Høy oppløsning Whole Mount<em> In Situ</em> Hybridisering innenfor sebrafisk embryoer å studere Gene Expression og funksjon
Summary
Sebrafisk, en liten tropisk fisk, har blitt en populær modell for å studere gen-funksjon i løpet av virveldyr utvikling og sykdom. Den tidsmessige og romlige ekspresjon av målgener kan bestemmes ved<em> In situ</em> Hybridisering. Vår forbedrede Protokollen tillater påvisning av lave rikelig transkripter med lav ikke-spesifikk bakgrunn signal.
Abstract
Denne artikkelen fokuserer på hel-mount in situ hybridisering (WISH) av sebrafisk embryoer. Den WISH-teknologi forenkler vurderingen av genuttrykk både i form av vev distribusjon og utviklingsstadiet. Protokoller er beskrevet for bruk av WISH av sebrafisk embryoer ved hjelp av antisense-RNA-prober merket med Digoxigenin. Prober blir generert ved å innlemme Digoxigenin-bundne nukleotider gjennom in vitro transkripsjon av genet maler som er klonet og lineært. De chorions av embryoer høstes ved definerte utviklingsstadier er fjernet før inkubasjon med spesifikke prober. Ved å følge en prosedyre vasking for å fjerne overskudd sonde, blir embryoene ble inkubert med anti-Digoxigenin-antistoff konjugert med alkalisk fosfatase. Ved å ansette en kromogent substrat for alkalisk fosfatase, kan spesifikk genekspresjon bli vurdert. Avhengig av nivået av genuttrykk hele prosedyren kan gjennomføres innen 2-3 dager.
Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) har dukket opp som en kraftig dyremodell for studier av virveldyr utvikling, sykdom, atferd, og i narkotika screening 1-3. Sebrafisk embryoer kan fås i store tall fra en enkelt kryss. Befruktning og utvikling skjer ex utero og optisk klare embryoer utvikler seg raskt. Kritiske utviklingsmessige hendelser inntreffer i løpet av første 48 timer etter befruktning (HPF). Dette inkluderer utseendet på orgel primordia og initiering av cytodifferentiation. Knockdown eller over-ekspresjon av proteiner kan oppnås ved mikroinjeksjon av embryoene med antisense-morfolino (MO) oligonukleotider eller mRNA på henholdsvis ett eller to cellestadiet (0.75 HPF).
Den WISH av sebrafisk embryo letter studiet av spatio-tidsbaserte uttrykk av spesifikke gener av interesse. Bruk av WISH teknikken etter mikroinjeksjon av befruktede egg med mRNA eller MO å over-uttress eller knockdown spesifikke protein nivåer avslører differensial regulering av andre gener.
Endringer i genuttrykk mønstre kan være korrelert med fenotypiske endringer og avdekke funksjon av målet gener under tidlig organogenesis. Siden prober kan være forberedt og lagret på forhånd, kan det ISH teknikk brukes for å avdekke genuttrykksmønster i minst 20 gener på en gang ved hjelp av seks-brønners plater og skreddersydde kurver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utviklet forbedrede fremgangsmåter for å visualisere RNA med høy oppløsning. Den in situ hybridisering prosedyrer blir utført ved hjelp av enkle skreddersydde kurver med porøse bottoms (figur 1). Embryoer behandlet ved hjelp av RNase-frie løsninger i 6-brønners plater ved romtemperatur under sterile betingelser.
Å skille embryoer kurver er laget av forskjellige fargede Eppendorf-rør. Kurver med eller uten felg brukes for enkel orientering, og for å…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
- Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
- Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W., Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
- Detrich, H. W., et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
- Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
- Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
- Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
- Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
- Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
- Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
- Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
