Nasale epitheelcellen, verkregen door middel van oppervlakkige schaaf biopsie van menselijke vrijwilligers, worden uitgebreid en overgebracht naar weefselkweek inserts. Bij het bereiken van confluentie, worden cellen gekweekt bij lucht-water grensvlak, waardoor culturen van trilharen en niet-haarcellen. Gedifferentieerde nasale epitheelcelkweken voorzien levensvatbare experimentele modellen voor het bestuderen van de respiratoire mucosa.
In vitro-modellen met humane primaire epitheliale cellen zijn essentieel begrijpen belangrijkste functies van de respiratoire epitheel in het kader van microbiële infecties of geïnhaleerd middelen. Directe vergelijkingen van cellen verkregen van zieke populatie kunnen we verschillende fenotypes karakteriseren en ontleden de onderliggende mechanismen bemiddelen veranderingen in de epitheliale cel functie. Het kweken van epitheliale cellen van de humane tracheobronchiale gebied is goed gedocumenteerd, maar is beperkt door de beschikbaarheid van menselijk longweefsel of invasiviteit van de verkrijging van de bronchiale biopsieën borstels. Nasale epitheelcellen worden verkregen door middel van veel minder invasief oppervlakkige neus schrapen biopsieën en onderwerpen kan meerdere keren worden biopsied zonder significante bijwerkingen. Bovendien, de neus is het toegangspunt tot de luchtwegen en daarmee een van de eerste sites die worden blootgesteld aan elke vorm van lucht overgedragen stressor, zoals microbiële agentia, Verontreinigende stoffen of allergenen.
In het kort, nasale epitheelcellen verkregen uit menselijke vrijwilligers worden uitgebreid op gecoate weefselkweek platen, en vervolgens overgebracht op celkweek inserts. Bij het bereiken van confluentie, cellen verder worden gekweekt bij de lucht-vloeistof-interface (ALI), enkele weken, met meer fysiologisch relevante omstandigheden schept. De ALI kweekomstandigheid gebruikt gedefinieerde media leidt tot een gedifferentieerd epitheel dat morfologische en functionele kenmerken vergelijkbaar met de menselijke nasale epitheel, met zowel trilharen en slijm producerende cellen vertoont. Weefselkweek inserts met gedifferentieerde nasale epitheelcellen kunnen worden gemanipuleerd op verschillende manieren, afhankelijk van de onderzoeksvragen (behandeling met farmacologische agentia, transductie met lentivirale vectoren, blootstelling aan gassen of infectie met microbiële agentia) en talrijke verschillende eindpunten vinden geanalyseerd cellulaire en moleculaire pathways, functionele changes, morfologie, enz.
In vitro modellen van gedifferentieerde menselijke nasale epitheelcellen onderzoekers kunnen geven tot nieuwe en belangrijke vragen pakken met organotypische experimentele modellen die de nasale epitheel in vivo grotendeels bootsen.
Doel van de techniek
Epitheelcellen (EC) in de luchtwegen zijn een van de eerste sites die rechtstreeks worden blootgesteld aan geïnhaleerde negatieve milieu-invloeden, zoals ziektekiemen, allergenen of luchtverontreinigende stoffen. EC meer dan een structurele belemmering: Zij fungeren als een schakelbord via de afgifte van oplosbare mediators 4-6 en de expressie van liganden / receptoren op hun surfac 7-9 initiëren en reguleren de immuunrespons respiratoire 1-3. Terwijl geïmmortaliseerde cellijnen kunnen worden gebruikt als modellen voor respiratoire EC studie in vitro, ze niet differentiëren in heterogene celpopulaties uit gepolariseerde trilharen en slijm producerende cellen, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in vivo. Belangrijke kenmerken van de respiratoire epitheel waargenomen in vivo Resumerend kan worden primaire luchtweg EC gebruikt. Daarom is ons doel was om onze methode waarbij nasale EC (NEM) te optimaliseren verkregen uit menselijke vrijwilligers. De NEC's worden uitgebreid en in vitro gekweekt, wat een celcultuur model van gedifferentieerde NEC's die veel van de kenmerken van de nasale epitheel gezien in vivo nabootst.
Motivering
Het gebruik van in vitro modellen met menselijke primaire EC nabootsen in vivo situatie – zoals beschreven in deze studie – geeft unieke mogelijkheden ziekte specifieke verschillen van EC, fysiologische parameters geassocieerd met het luchtwegepitheel of de interacties tussen EC en andere celtypes te bestuderen, zoals dendritische cel 10, natural killer cellen 11 of macrofagen. Verschillende bestaande methoden maken gebruik van bronchiale EC, die invasief via borstel biopten kan worden verkregen tijdens bronchoscopies, of op een andere wijze weggegooid longweefsel 12-17. Bovendien, commerciële bronnen om volledig gedifferentieerde menselijke luchtwegen epitheelcelkweken verkrijgen bestaan (EpiAirway model uit MatTek, Ashland, MA, Cloneticsvan Lonza, Bazel, Zwitserland, MucilAir van Epithelix Sars, Genève Zwitserland), waar onderzoekers kunnen kiezen uit verschillende donoren. Vanwege de beperkte pool van commercieel beschikbare epitheelcellen, beperkt of voorgeschreven set parameters, de kosten verbonden aan commercieel verkrijgen primaire menselijke luchtwegen EC en de beperkte toegang tot verwijderd longweefsel of pas verkregen humane bronchiale biopsie weefsel, verbieden vele onderzoekers van uitvoeren van onderzoek bij volledig gedifferentieerde menselijke luchtwegen EC. Daarom hebben we besloten om een techniek die 1) zal gebruik maken van niet-invasief verkregen menselijke NEM, 2) een protocol waardoor culturen van gedifferentieerde menselijke luchtwegepitheel, en 3) zijn reproduceerbaar in de meeste lab instellingen met een bestaande weefselkweek infrastructuur te ontwikkelen.
Voordelen ten opzichte van bestaande technieken / modellen
Geweest nieuw NEC in vergelijking met bronchiale of kleine luchtwegen EC, is veel minder invasief, individueles kan meerdere keren worden biopsied zonder significante bijwerkingen, en oppervlakkige nasale schrapen biopten kunnen worden uitgevoerd in de zieke bevolking die anders niet in aanmerking zouden komen voor onderzoeksgerelateerde bronchoscopies. Niet-invasieve oppervlakkige schaaf biopten naar NEC te verkrijgen, zodat de onderzoeker om donor specificatie stellen a priori, zoals leeftijd, geslacht, status van de ziekte, enz., in overeenstemming met het doel van het onderzoek te worden uitgevoerd. Dus, bij het ontwerpen van onderzoeken onderzoekers zijn niet beperkt door klinisch beschikbaar weefsels / epitheliale specimen, kopen dure gedifferentieerde celcultuur modellen van commerciële leveranciers, of ontwerp invasieve bronchoscopie studies. Bovendien, het gemak om NEM verkrijgen vergroot de mogelijkheid om experimenten in cellen van verschillende donoren, die statistische validatie van de waargenomen resultaten verbetert. Ten slotte, de neus is een van de eerste sites die worden blootgesteld aan elke vorm van stressoren lucht overgedragen. Aldus genereren in organotypischevitro kweeksystemen nabootsen het nasale epitheel zijn nuttig voor het bestuderen inhalatie van virale deeltjes, stoffen, allergenen, of gassen, die gemakkelijk kan worden bereikt door deze celcultuur.
EC Respiratory niet alleen een fysieke barrière voor het menselijk lichaam te beschermen tegen exogene stimuli 20, maar ook als een schakelbord te initiëren en te reguleren respiratoire immuunsysteem responsen 1-3 via uitscheiding van oplosbare mediatoren of direct receptor-ligand cel-cel interacties. Om verdere analyse van de rol van EC in de immuunrespons op potentiaalverschillen tussen EC van zieke populaties te onderzoeken of de effecten van exogene stressoren EC bestuderen, is het belangrijk…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag Lisa Dailey bedanken voor de nuttige ingangen.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (ES013611 en HL095163), de Steward Medical Research Institute (FAMRI) en de Environmental Protection Agency (CR83346301) en verklaart geen belangenconflict. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health. Hoewel de in dit artikel beschreven onderzoek is mede gefinancierd door het US Environmental Protection Agency via samenwerkingsovereenkomst CR83346301 met het Center for Environmental Medicine, Astma en Long Biologie aan de Universiteit van North Carolina, Chapel Hill, is het niet onderworpen aan de bureau's nodig collegiale en beleidsevaluatie en dus niet noodzakelijk overeen met de standpunten van het agentschap, en geen officiële goedkeuring moet worden afgeleid. Vermelden of handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik. Loretta Müller wordt ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation met een persoonlijke subsidie.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nasal speculum | Welch Allyn | Model 22009 | 9 mm, reusable polyproylene | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Operating otoscope | Welch Allyn | Model 21700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rhino probe cell cuvette | Arlington Scientific | SY-96-092 | bend the head of the cuvette a little more | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
12-well culture plates | Corning | 3512 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Transwell membrane cell culture inserts | Corning | 3460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tissue culture flask | Corning | 430639 and 430641 | T25 and T75 vented flask | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) | Gibco | 11875 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium | Cell applications | 511-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3170 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium Bicarbonate 7.5% solution | Gibco | 25080 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NuSerum | BD Biosciences | 355104 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BAMBANKER freezing media | BAMBANKER | 302-14681 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CoolCell | Biocision | HTBCS-136 | (CryoPrep alcohol-free cell freezing container) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PureCol | AdvancedBioMatrix | 5005-B | dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HBSS with Ca2 and Mg2+ | Gibco | 14025 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNAse 1 | Sigma | DN25 | Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red | Gibco | 25200-056 | Use at it is | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) | Sigma | T6522 | Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Retinoic acid | Sigma | R7632 | Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate | Gibco | 11995 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bovine Pituitary Extract | Gibco | 13028-014 | Used for BEGM ALI media. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nystatin | Sigma | N4014-50 mg | Make up a solution of 3.3 mg/ml. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PneumaCult-ALI media | StemCell | 5001 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrocortisone | StemCell | 7904 | Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) | StemCell | 7980 | Use at it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Filter flasks (500 ml) | Corning | 431097 | 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Filter tubes (50 ml) | Millipore | SCGP00525 | Steriflip, 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Pipette tips – ART Barrier Tips | Molecular Bioproducts | 2139RI, 2069RI, 2179RI | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ddH2O, absolute ethanol, ice | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CO2 incubator | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
refrigerated centrifuge | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
biological safety cabinet | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gloves | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
lab coat with tight cuffs | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|