मानव स्वयंसेवकों की सतही परिमार्जन बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त की नाक उपकला कोशिकाओं, ऊतकों संस्कृति आवेषण पर विस्तार किया है और स्थानांतरित कर रहे हैं. Confluency तक पहुँचने पर, कोशिकाओं रोमक और गैर रोमक कोशिकाओं की संस्कृतियों उपज, हवा तरल इंटरफेस में बड़े हो रहे हैं. विभेदित नाक उपकला सेल संस्कृतियों सांस mucosa के अध्ययन के लिए व्यवहार्य प्रयोगात्मक मॉडल उपलब्ध कराते हैं.
का उपयोग इन विट्रो मॉडल में मानव प्राथमिक उपकला कोशिकाओं माइक्रोबियल संक्रमण या साँस एजेंटों के संदर्भ में श्वसन उपकला के महत्वपूर्ण कार्यों को समझने में जरूरी है. रोगग्रस्त आबादी से प्राप्त कोशिकाओं की प्रत्यक्ष तुलना हमें अलग phenotypes विशेषताएँ और उपकला सेल समारोह में परिवर्तन मध्यस्थता अंतर्निहित तंत्र काटना करने की अनुमति. मानव tracheobronchial क्षेत्र से उपकला कोशिकाओं संवर्धन अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, लेकिन ब्रोन्कियल ब्रश बायोप्सी प्राप्त करने के साथ जुड़े मानव फेफड़े के ऊतकों या invasiveness की उपलब्धता सीमित है. नाक उपकला कोशिकाओं बहुत कम आक्रामक सतही नाक परिमार्जन बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं और विषयों कोई महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव के साथ कई बार biopsied किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, नाक श्वसन प्रणाली को प्रवेश बिंदु है और इसलिए इस तरह के सूक्ष्म जीवाणु एजेंट के रूप में वायु जनित तनाव के किसी भी प्रकार के संपर्क में होने वाली पहली साइटों में से एक, प्रदूषण, या एलर्जी.
संक्षेप में, मानव स्वयंसेवकों से प्राप्त नाक उपकला कोशिकाओं लेपित टिशू कल्चर प्लेट पर विस्तार किया है, और फिर सेल संस्कृति आवेषण पर स्थानांतरित कर रहे हैं. Confluency तक पहुँचने पर, कोशिकाओं को और अधिक physiologically प्रासंगिक परिस्थितियों बनाता है जो कई हफ्तों के लिए, हवा तरल इंटरफेस (अली) में संवर्धित किया जाना जारी है. अली संस्कृति हालत उत्पादन रोमक और बलगम दोनों कोशिकाओं के साथ मानव नाक उपकला के समान रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं, दर्शाती है कि एक विभेदित उपकला के लिए अग्रणी परिभाषित मीडिया का उपयोग करता है. विभेदित नाक उपकला कोशिकाओं के साथ ऊतक संस्कृति आवेषण अनुसंधान सवाल (औषधीय एजेंटों के साथ इलाज, lentiviral वैक्टर, गैसों के संपर्क में, या माइक्रोबियल एजेंटों के साथ संक्रमण के साथ पारगमन) के आधार पर विभिन्न तरीकों से में चालाकी और से लेकर कई अलग endpoints के लिए विश्लेषण किया जा सकता है सेलुलर और आणविक मार्ग, कार्यात्मक चर्चाAnges, आकृति विज्ञान, आदि
विभेदित मानव नाक उपकला कोशिकाओं की इन विट्रो मॉडल में काफी हद तक इन विवो में नाक उपकला कि नकल organotypic प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग करके उपन्यास और महत्वपूर्ण अनुसंधान सवालों का पता करने के लिए जांचकर्ताओं सक्षम हो जाएगा.
तकनीक का लक्ष्य
वायुमार्ग में उपकला कोशिकाओं (ईसीएस) सीधे ऐसी रोगजनकों, एलर्जी या वायु प्रदूषण के रूप में साँस पर्यावरण तनाव, के संपर्क में होने वाली पहली साइटों में से एक हैं. ईसीएस एक संरचनात्मक बाधा तुलना में अधिक हैं: वे घुलनशील मध्यस्थों 4-6 और उनके surfac 7-9 पर ligands / रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति की रिहाई के माध्यम से सांस की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1-3 आरंभ और विनियमित करने के लिए एक स्विचबोर्ड के रूप में कार्य. अमर सेल लाइनों विट्रो में सांस ईसीएस अध्ययन करने के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, वे इन विवो में मनाया जाता है के समान polarized रोमक और बलगम उत्पादक कोशिकाओं से बना विषम सेल आबादी में अंतर करने में विफल. Vivo में मनाया श्वसन उपकला के महत्वपूर्ण विशेषताओं पुनरावृत्ति करना, प्राथमिक airway ईसीएस इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, हमारे लक्ष्य नाक ईसीएस (एनईसीएस) का उपयोग हमारी विधि का अनुकूलन के लिए था मानव स्वयंसेवकों से प्राप्त. एनईसीएस विवो में देखा नाक उपकला की सुविधाओं के कई mimics जो विभेदित एनईसीएस की एक सेल संस्कृति मॉडल उपज, इन विट्रो में विस्तार किया है और सुसंस्कृत हैं.
औचित्य
vivo स्थिति में नकल उतार मानव प्राथमिक ईसीएस के साथ इन विट्रो मॉडल का उपयोग – इस अध्ययन में वर्णित के रूप में -, रोग ईसीएस के विशिष्ट मतभेद, airway उपकला के साथ जुड़े शारीरिक मापदंड, या ईसीएस और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय संभावनाओं देता है इस तरह के वृक्ष के समान सेल के रूप में 10, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं 11 या मैक्रोफेज. कई मौजूदा तरीकों bronchoscopies दौरान ब्रश बायोप्सी के माध्यम से invasively प्राप्त, या अन्यथा खारिज फेफड़े के ऊतकों 12-17 से किया जा सकता है जो ब्रोन्कियल ईसीएस, उपयोग. इसके अलावा, पूरी तरह से विभेदित मानव airway उपकला सेल संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए वाणिज्यिक सूत्रों MatTek, Ashland, एमए, Clonetics से (EpiAirway मॉडल मौजूद हैंजांचकर्ताओं अलग दाताओं से चुन सकते हैं जहां Lonza, बेसल, स्विट्जरलैंड, Epithelix सार्स से MucilAir, जिनेवा स्विट्जरलैंड), से. हालांकि, क्योंकि सीमित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकला कोशिकाओं, या मापदंडों के निर्धारित सेट के सीमित पूल, व्यावसायिक रूप से प्राथमिक मानव airway ईसीएस प्राप्त करने के साथ जुड़े लागत, और त्याग फेफड़े के ऊतकों या हौसले से प्राप्त मानव ब्रोन्कियल बायोप्सी ऊतक तक सीमित पहुंच, कई जांचकर्ताओं निषेध पूरी तरह से विभेदित मानव airway ईसीएस अध्ययन के संचालन से. इसलिए, हम 1), गैर invasively प्राप्त मानव एनईसीएस उपयोग 2) विभेदित मानव airway उपकला की संस्कृतियों से बेदखल एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और 3) एक मौजूदा टिशू कल्चर बुनियादी सुविधाओं के साथ सबसे प्रयोगशाला सेटिंग्स में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो जाएगा कि एक तकनीक विकसित करने के लिए निकल पड़े.
मौजूदा तकनीक / मॉडल से अधिक लाभ
ताजा एनईसीएस प्राप्त करने, ब्रोन्कियल या छोटे airway ईसी की तुलना में, बहुत कम आक्रामक, व्यक्तिगत हैकोई महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव के साथ कई बार biopsied किया जा सकता है, और सतही नाक परिमार्जन बायोप्सी अन्यथा अनुसंधान से संबंधित bronchoscopies लिए पात्र नहीं होगा जो रोगग्रस्त आबादी में आयोजित किया जा सकता है. एनईसीएस प्राप्त करने के लिए अवेध्य सतही परिमार्जन बायोप्सी अन्वेषक पूरा किया जा करने के लिए अनुसंधान उद्देश्य के अनुसार आदि आयु, लिंग, रोग की स्थिति, सहित, दाता विनिर्देश एक प्राथमिकताओं सेट करने के लिए अनुमति देते हैं. अनुसंधान अध्ययन डिजाइन इस प्रकार, जब जांचकर्ताओं वाणिज्यिक विक्रेताओं, या डिजाइन आक्रामक ब्रोंकोस्कोपी पढ़ाई से महंगा विभेदित सेल संस्कृति मॉडल की खरीद, चिकित्सकीय उपलब्ध ऊतकों / उपकला नमूना द्वारा ही सीमित नहीं हैं. इसके अलावा, एनईसीएस प्राप्त करने के लिए आसानी मनाया निष्कर्षों के सांख्यिकीय सत्यापन को बढ़ाता है, जो अलग दाताओं से कोशिकाओं में प्रयोगों का संचालन करने की क्षमता बढ़ जाती है. अन्त में, नाक वायु जनित तनाव के किसी भी प्रकार के संपर्क में होने वाली पहली साइटों में से एक है. इस प्रकार, में organotypic सृजननाक उपकला नकल उतार विट्रो संस्कृति सिस्टम को आसानी से इस सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है जो वायरल कणों, प्रदूषण, एलर्जी, या गैसों की साँस लेना के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं.
श्वसन ईसीएस एक्सोजेनस उत्तेजनाओं 20 से मानव शरीर की रक्षा, लेकिन यह भी घुलनशील मध्यस्थों या प्रत्यक्ष रिसेप्टर ligand सेल सेल बातचीत के स्राव के माध्यम से शुरू करने और सांस की प्रतिरक्षा रक्षा प्रतिक्…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों उपयोगी जानकारी के लिए लिसा Dailey धन्यवाद देना चाहूंगा.
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (ES013611 और HL095163) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, उड़ान परिचर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (FAMRI), और पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (CR83346301) और ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. इस आलेख में वर्णित अनुसंधान पर्यावरण चिकित्सा, अस्थमा और उत्तरी कैरोलिना चैपल हिल के विश्वविद्यालय में फेफड़े जीवविज्ञान के लिए केंद्र के साथ सहयोग समझौता CR83346301 के माध्यम से अमेरिका पर्यावरण संरक्षण एजेंसी द्वारा वित्त पोषित में भाग गया है, यह अधीन नहीं किया गया है एजेंसी की आवश्यकता सहकर्मी और नीति की समीक्षा और इसलिए जरूरी एजेंसी के विचारों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और कोई आधिकारिक समर्थन inferred किया जाना चाहिए. मेंशन ओF व्यापार के नाम या वाणिज्यिक उत्पादों के उपयोग के लिए बेचान या सिफारिश का गठन नहीं है. लोरेटा मुलर एक निजी अनुदान के साथ स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nasal speculum | Welch Allyn | Model 22009 | 9 mm, reusable polyproylene | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Operating otoscope | Welch Allyn | Model 21700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rhino probe cell cuvette | Arlington Scientific | SY-96-092 | bend the head of the cuvette a little more | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
12-well culture plates | Corning | 3512 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Transwell membrane cell culture inserts | Corning | 3460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tissue culture flask | Corning | 430639 and 430641 | T25 and T75 vented flask | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) | Gibco | 11875 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium | Cell applications | 511-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3170 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium Bicarbonate 7.5% solution | Gibco | 25080 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NuSerum | BD Biosciences | 355104 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
BAMBANKER freezing media | BAMBANKER | 302-14681 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CoolCell | Biocision | HTBCS-136 | (CryoPrep alcohol-free cell freezing container) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PureCol | AdvancedBioMatrix | 5005-B | dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HBSS with Ca2 and Mg2+ | Gibco | 14025 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNAse 1 | Sigma | DN25 | Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red | Gibco | 25200-056 | Use at it is | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) | Sigma | T6522 | Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Retinoic acid | Sigma | R7632 | Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol. |
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DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate | Gibco | 11995 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bovine Pituitary Extract | Gibco | 13028-014 | Used for BEGM ALI media. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nystatin | Sigma | N4014-50 mg | Make up a solution of 3.3 mg/ml. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PneumaCult-ALI media | StemCell | 5001 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrocortisone | StemCell | 7904 | Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) | StemCell | 7980 | Use at it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Filter flasks (500 ml) | Corning | 431097 | 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Filter tubes (50 ml) | Millipore | SCGP00525 | Steriflip, 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Pipette tips – ART Barrier Tips | Molecular Bioproducts | 2139RI, 2069RI, 2179RI | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ddH2O, absolute ethanol, ice | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CO2 incubator | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
refrigerated centrifuge | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
biological safety cabinet | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gloves | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
lab coat with tight cuffs | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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