Dyrking av menneskelig Nasal Epitelceller på Air Flytende Interface

Summary

Nese epitelceller, innhentet gjennom overfladisk skrape biopsi av frivillige, er utvidet og overført til vevskulturstudier inserts. Når du har nådd konfluens, er celler dyrket på luft væske-grensesnittet, som gir kulturer av ciliated og ikke-ciliated celler. Differensiert nasal epitel cellekulturer gi levedyktige eksperimentelle modeller for å studere luftslimhinnen.

Abstract

In vitro-modeller med humane primære epitelceller er avgjørende for å forstå viktige funksjoner av respiratorisk epitel i sammenheng med mikrobielle infeksjoner eller inhalert agenter. Direkte sammenligninger av celler hentet fra syke populasjoner tillate oss å karakterisere ulike fenotyper og dissekere de underliggende mekanismene som medierer endringer i epiteliale cellefunksjon. Dyrking epitelceller fra den menneskelige trakeobronkialområdet har vært godt dokumentert, men er begrenset av tilgjengeligheten av menneskelig lungevev eller invasivitet forbundet med å skaffe bronkial børster biopsier. Nese epitelceller er innhentet gjennom mye mindre invasive overfladiske nasal skrape biopsier og fagene kan vevsprøve flere ganger uten vesentlige bivirkninger. I tillegg er nesen inngangspunkt for luftveiene og derfor en av de første stedene å bli utsatt for noen form for luftbåren stressor, som for eksempel mikrober, forurensning, eller allergener.

Kort fortalt blir nasale epitelceller oppnådd fra frivillige mennesker utvidet på belagte vevskulturplater, og deretter overført til cellekulturinnsatser. Da nådde konfluens, cellene fortsette å bli dyrket ved luft-væske-grensesnittet (ALI), i flere uker, noe som skaper mer fysiologisk relevante betingelser. Den ALI kultur tilstand bruker definerte medier fører til en differensiert epitel som viser morfologiske og funksjonelle egenskaper som ligner på den menneskelige nasal epitel, med både ciliated og slim produserende celler. Tissue culture innsatser med differensierte nasale epitelceller kan manipuleres på en rekke måter, avhengig av de problemstillinger (behandling med farmakologiske midler, transduksjon med lentiviral vektorer, eksponering mot gasser, eller infeksjon med mikrobielle midler) og analysert for en rekke forskjellige sluttpunkter som strekker seg fra cellulære og molekylære stier, funksjonell lmanges, morfologi, etc.

In vitro modeller for differensierte menneskelige nese epitelceller vil gjøre det mulig etterforskerne å løse nye og viktige forskningsspørsmål ved hjelp av organotypic eksperimentelle modeller som i stor grad etterligne neseepitel in vivo.

Introduction

Målet med teknikken

Epitelceller (ECS) i luftveiene er blant de første stedene å bli direkte utsatt for inhalert miljømessige stressfaktorer, som patogener, allergener eller luftforurensning. Egenkapitalbevis er mer enn en strukturell barriere: De fungerer som et sentralbord for å initiere og regulere luftimmunrespons ^1-3 via utgivelsen av løselige meklere ^4-6 og uttrykket av ligander / reseptorer på deres surfac ^7-9. Mens foreviget cellelinjer kan brukes som modeller for å studere luftegenkapitalbevis in vitro, klarer de ikke å differensiere i heterogene celle populasjoner består av polarisert ciliated og slim produserende celler, i likhet med hva som er observert in vivo. For å rekapitulere viktige kjennetegn ved respiratorisk epitel observert in vivo, kan primærluftveisegenkapitalbevis benyttes. Derfor, målet vårt var å optimalisere vår metode å benytte nasal egenkapitalbevis (NEC) innhentet fra frivillige. De NEC skal utvides og dyrket in vitro, noe som gir en cellekultur modell av differensierte NEC som etterligner mange av funksjonene i neseepitel sett in vivo.

Rasjonale

Bruken av in vitro-modeller med humane primære EKB etterligne in vivo situasjon – slik det er beskrevet i denne studien – gir unike muligheter for å studere sykdomsspesifikke forskjeller av EKB, fysiologiske parametere forbundet med luftveiene epitel, eller interaksjonen mellom EKB-og andre celletyper, slik som dendrittiske cellen ^10, naturlige drepeceller ¹¹ eller makrofager. Flere eksisterende metoder utnytte bronkial egenkapitalbevis, som kan fås invasively via pensel biopsier under bronchoscopies, eller fra annet kasserte lungevev ^12-17. I tillegg, kommersielle kilder for å få fullt differensierte menneskelige luftveis epitelial cellekulturer eksisterer (EpiAirway modell fra Mattek, Ashland, MA, Cloneticsfra Lonza, Basel, Sveits, MucilAir fra Epithelix Sars, Genève Sveits), hvor etterforskere kan velge fra ulike givere. Imidlertid, på grunn av den begrensede pool av kommersielt tilgjengelige epitelceller, begrenset eller foreskrevet sett av parametre, er kostnadene forbundet med kommersielt skaffe primære humane luftveier ECS, og den begrensede tilgang på kassert lungevev eller ferskt oppnådd human bronkial vevsprøver, forbyr mange forskere fra å gjennomføre studier i fullt differensierte menneskelige luftveisegenkapitalbevis. Derfor setter vi ut for å utvikle en teknikk som gjør en) utnytte ikke-invasiv innhentet menneskelige NEC, 2) gi en protokoll som gir kulturer av differensiert menneskelige luftveis epitel, og 3) kunne reproduseres i de fleste lab innstillinger med en eksisterende vev kultur infrastruktur.

Fordeler fremfor eksisterende teknikker / modeller

Innhenting av ferske NEC, sammenlignet med bronkial eller små luftveier EKB, er mye mindre invasiv, individuelles kan vevsprøve flere ganger uten vesentlige bivirkninger, og overfladiske nese skrape biopsier kan gjennomføres i syke populasjoner som ellers ikke ville kvalifisere for forskningsrelaterte bronchoscopies. Invasiv overfladiske skrape biopsier å få NEC skal tillate etterforsker for å sette donor spesifikasjonen a priori, inkludert alder, kjønn, sykdomsstatus, etc. i henhold til forskning mål å være dyktig. Dermed når du utformer forskningsstudier etterforskere er ikke begrenset av klinisk tilgjengelige vev / epitel prøven, kjøpe dyre differensierte cellekultur modeller fra kommersielle leverandører, eller design invasive bronkoskopi studier. I tillegg er lette å få tak i NEC øker evnen til å utføre eksperimenter på celler fra forskjellige donorer, noe som forbedrer statistisk validering av observerte resultater. Til slutt, er nesen en av de første stedene å bli utsatt for noen form for luftbåren stressfaktorer. Dermed genererer organotypic ivitro kultursystemer etterligne den nasale epitel er nyttige for å studere inhalering av virale partikler, forurensninger, allergener, eller gasser, som lett kan oppnås ved å bruke denne cellekultursystem.

Protocol

En. Forbered Plastic Ware: Coat Plate Legg 500 mL PureCol (1:100 fortynnet med sterilt vann) til hver brønn av en 12-brønns plate. Inkuber ved 37 ° C i en inkubator i 30 minutter, fjern PureCol og skylles med HBSS rett før cellene blir tilsatt til platen (se trinn 3.1 nedenfor). 2. Innhenting og pretreating Biopsi of Human NEC Nasal skrape biopsi Skaffe overfladiske egenkapitalbevis langs nesemusling i direkte visjon gjennom en 9 mm gjenbruk…

Representative Results

NEC dyrket etter den her beskrevne protokoll re-differensieres til et heterogent lag av EKB sammensatt av ciliated og ikke-ciliated celler, som representerer in vivo situasjonen (fig. 1). Noen av de differensierte NEC skal slim produserende (celler flekker i blått ved hjelp av AB / PAS, Figur 1B). Selv om det her presenteres protokollen er optimalisert, kan differensiering variere med hensyn til fordelingen av de samlede cellepopulasjoner (dvs. ulike prosenter av cili…

Discussion

Luftveisegenkapitalbevis gir ikke bare en fysisk barriere for å beskytte kroppen fra eksogene stimuli ^20, men også fungere som et sentralbord for å initiere og regulere luftveisimmunforsvarsresponser ^1-3 via sekresjon av løselige meglere eller direkte reseptor-ligand celle-celle interaksjoner. For ytterligere å studere rollen til ECS i immunresponsen, for å undersøke mulige forskjeller mellom ECS fra syke populasjoner, eller for å studere virkningene av eksogene belastninger på ECS, er det…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Nasal speculum	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope	Welch Allyn	Model 21700
Rhino probe cell cuvette	Arlington Scientific	SY-96-092	bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates	Corning	3512
Transwell membrane cell culture inserts	Corning	3460
Tissue culture flask	Corning	430639 and 430641	T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine)	Gibco	11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium	Cell applications	511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3170	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	Gibco	25080	Use as it is.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Use as it is.
BAMBANKER freezing media	BAMBANKER	302-14681	Use as it is.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red	Gibco	25200-056	Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI)	Sigma	T6522	Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid	Sigma	R7632	Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate	Gibco	11995
Bovine Pituitary Extract	Gibco	13028-014	Used for BEGM ALI media.
Nystatin	Sigma	N4014-50 mg	Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100	Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone	StemCell	7904	Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml)	StemCell	7980	Use at it is.
Filter flasks (500 ml)	Corning	431097	0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml)	Millipore	SCGP00525	Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips – ART Barrier Tips	Molecular Bioproducts	2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
			Media and solutions used: Recipe Used for General remark: always warm the media to room temperature BEGM media 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid (mix them half-half and filter ) 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements digestion of the biopsy BEGM+ media 50 ml BEGM media maintaining cells on plastic in the plates (passage0) 10 μl retinoic acid (working solution) seeding cells in the flask (passage1; partially) maintain the cells in the flask BEGM++ media 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements seeding fresh cells in 12-well plate on plastic 1 ml Sodium BiCarb maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially) 2.5 ml NuSerum seeding cells in the flask (passage1; partially) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Maintaining cells on the transwell before they go ALI 250 ml BEGM including supplements 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution) 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution) 75 μl BSA (10 mg/ml solution) 200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution) 200 μl dissolved hydrocortisone As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts 4250 μl dissolved sodium chloride 540 μl ddH2O 10 μl absolute ethanol Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Base medium for all three PneumaCult-ALI media 50 ml PneumaCult 10x Supplement The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark (this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C) PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution) 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)