منهج في التثقيف الجنينية<em> C. ايليجانس</em> خلايا
Summary
نحن هنا وصف البروتوكول المنقح للثقافة واسعة النطاق من الجنينية C. ايليجانس الخلايا. الجنينية C. ايليجانس الخلايا المستزرعة في المختبر باستخدام هذا الأسلوب، ويبدو أن التفريق وألخص التعبير عن الجينات بطريقة معينة من الخلايا. التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا أو عزل أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة الأخرى يمكن تطبيقها على C. ايليجانس الخلايا المستزرعة.
Abstract
C. ايليجانس هو نظام نموذجي قوية، حيث التقنيات الوراثية الجزيئية وقابلة للتطبيق بسهولة. حتى وقت قريب على الرغم من التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا وعزل أنواع معينة من الخلايا، لا يمكن تطبيقها في C. ايليجانس. وكان يرجع ذلك إلى حقيقة أن تقتصر الأنسجة داخل بشرة الضغط الذي لا يهضم بسهولة عن طريق العلاج مع الانزيمات و / أو المنظفات هذا القيد. على أساس العمل الرائد في وقت مبكر عن طريق ليرد بلوم، كريستنسن وزملاؤه 1 وضعت طريقة قوية لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في نطاق واسع. يتم عزل البيض من البالغين حامل عن طريق العلاج مع التبييض / هيدروكسيد الصوديوم وعلاجها في وقت لاحق مع كيتيناز لإزالة قشر البيض. ثم يتم فصل الخلايا الجنينية من قبل pipetting اليدوي ومطلي على الزجاج المغطاة الركيزة في وسائل الإعلام التخصيب المصل. في غضون 24 ساعة من زنازين العزل تبدأ في التفريق عن طريق تغيير التشكل وبالإعراب عن MARKE خلية معينةروبية. C. ايليجانس الخلايا مثقف باستخدام هذا الأسلوب البقاء على قيد الحياة لمدة تصل 2 أسابيع في المختبر، وكانت تستخدم للالكهربية، immunochemical، ويحلل التصوير، فضلا عن أنها تم فرزها واستخدامها لالتنميط ميكروأري.
Introduction
انواع معينة ايليجانس (C. ايليجانس) هو كائن نموذج قوي للتحقيق الأسس الجزيئية وظيفة الخلوية، والتمايز، والسلوك. بينما في الجينوم، الأيض، المسارات البنائية تشبه الفقاريات '، قابلية الإستطراق الوراثية والجزيئية التي هي أكبر بكثير 2. بين مزاياه وحجمها والتشريح بسيطة، ودورة الحياة السريع (3 أيام في 25 درجة مئوية)، فترة حياة قصيرة (2 أسابيع)، وعدد كبير من ذرية (> 200). نظرا لطبيعتها خنثوي ودورة حياة قصيرة، التلاعب الجزيئية والجينية هي واضحة في C. ايليجانس، بما في ذلك جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 3،4 وتطبيق تقنيات الجينات تدق إلى أسفل مثل تدخل الحمض النووي الريبي 5. C. الجسم ايليجانس وقشر البيض هي شفافة. لذا الخلايا يمكن تصور بسهولة في كل من الكبار والجنين باستخدام المجهر القياسية. في السنوات ال 40 الماضية، وC. ايليجانس </م> وقد خلق مجتمع الموارد لا تقدر بثمن لC. البحث ايليجانس بما في ذلك مجموعة كبيرة من المسوخ، وبالضربة القاضية المعدلة وراثيا، وصفا مفصلا لعلم التشريح والتنمية 6،7، بما في ذلك إعادة كاملة للجهاز العصبي 8، والجينوم التسلسل تماما وهو مشروح بشكل جيد ومتاحة للمجتمع بأكمله ( www.wormbase.com ).
على الرغم من العديد من المزايا، وبعض المناهج التجريبية تم تحدي في C. ايليجانس. وتشمل هذه تلك التي تتطلب الوصول إلى غشاء البلازما من الخلايا والأنسجة أو عزل أنواع الخلايا. في الواقع C. تقتصر الأنسجة ايليجانس داخل هيكل عظمي الهيدروستاتيكي الضغط، والتي لا يتم هضمها بسهولة عن طريق العلاج الأنزيمية أو المنظفات. في نهاية 1990s ميريام غودمان وجانيت ريتشموند رائدة أساليب التسجيلات الكهربية من C. ايليجانسالخلايا العصبية والخلايا العضلية في الموقع 9،10. في حين أن هذه الأساليب قدم لنا معلومات هامة عن العصبية وظيفة العضلات في الجسم الحي، فهي صعبة وانخفاض الإنتاجية. وقد وضعت وسائل بديلة لدراسة وظيفة الخلايا في الجسم الحي، ومعظمهم لا سيما في مجال التصوير الكالسيوم الجسم الحي باستخدام أجهزة استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا مثل GCamP وCAMELEON 11-13. على الرغم من هذه الأساليب، لا تسمح باستخدام أدوات الدوائية لأنها تطبق على الحيوانات الحية سليمة.
المحاولة الأولى في زراعة C. وقدم الخلايا ايليجانس في المختبر في نطاق واسع من قبل ليرد بلوم أثناء إعداد أطروحة الدكتوراه 14. للأسف، واجه صعوبات مع التصاق الفقراء من الخلايا إلى الركيزة، وسوء تمايز الخلايا والبقاء على قيد الحياة حالت دون قيام هذا البروتوكول في وقت مبكر باعتبارها طريقة قوية ثقافة الخلية. في عام 1995 نشرت إدغار وزملاؤه إجراءللتحقيق في انقسام الخلايا والتشكل من خلال العزلة وثقافة C واحد. ايليجانس أجنة 15. الخلايا الجنينية التي حصل عليها الهضم من قشر البيض مع مزيج من العلاج الأنزيمية والتفكك دليل، واصلت لتتكاثر، وتنتج ما يصل الى 500 ~ 15 الخلايا. في وقت لاحق، ليونج وزملاء العمل مثقف أعداد صغيرة من لدراسة التشكل عن Blastomeres المعوية. أنها أظهرت أن واحدا في المختبر معزولة E قسيم أرومي إنتاج الخلايا المعوية الاستقطاب التي خلقت بنية مشابهة لمعة الأمعاء من خلال التفاعل مع بعضهم البعض من خلال تقاطعات الملتصقة القمي 16. كما ذكرت بخنر وزملاؤه طريقة مماثلة لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر 17.
على أساس هذا العمل في وقت مبكر، وضعت كريستنسن وزملاؤه بروتوكول قوية لزراعة الجنينية C. ايليجانس الخلايا في المختبر 1. همأظهرت أن معزولة C. ايليجانس الخلايا يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا المختلفة، والمحافظة على الميزات التي يمتلكها في الجسم الحي، بما في ذلك التعبير عن علامات خلية محددة. العديد من التقنيات التي تشكل تحديا في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على معزولة C. ايليجانس الخلايا الجنينية. وتشمل هذه الكهربية 1،18 19، والتصوير، وتقنيات immunochemical 20،21، وكذلك عزل أنواع معينة من الخلايا عن طريق خلية نيون المنشط الفرز (FACS) لبناء مكتبات [كدنا] خلية محددة 22،23. تقنيات الجينات ضربة قاضية مثل تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يمكن تطبيقها على مثقف C. ايليجانس الخلايا 1 ورواية أسلوب وضع العلامات الأيضية باستخدام Azido السكر كأداة لاكتشاف بروتين سكري تم تطويرها مؤخرا للمثقف في المختبر C. ايليجانس الخلايا 24.
في الختام، يوسع طريقة زراعة الخلايا المصفوفة ستقنيات و التي يمكن تطبيقها على C. ايليجانس نموذج في محاولة فك وظيفة الجين في سياق كائن حي. نحن هنا وصف بروتوكول لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر، والتي تقوم أساسا على البروتوكول وصف لأول مرة من قبل كريستيانسن و1 الزملاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. ايليجانس هو كائن نموذج فك رموز قوية لمسارات الجينية التي تساهم في التنمية والسلوك والشيخوخة. يلائمها ينبع في المقام الأول من السهولة التي يمكن التلاعب بها وراثيا ومن دورة حياة قصيرة. على الرغم يلائمها، C. ايليجانس لها حدودها. C. الخلايا ايليجانس ض…
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
References
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. . Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. 유전학. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
