Een methode voor het kweken van embryonale<em> C. elegans</em> Cellen
Summary
We beschrijven hier een herziene protocol voor grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. Embryonale C. elegans cellen gekweekt in vitro gebruik van deze methode, blijken differentiëren en herhalen de expressie van genen in een celspecifieke wijze. Technieken die directe toegang tot de cellen of isolatie van specifieke celtypen van andere weefsels vereisen, kunnen worden toegepast C. elegans gekweekte cellen.
Abstract
C. elegans is een krachtig modelsysteem, waarin de genetische en moleculaire technieken zijn eenvoudig toepasbaar. Tot voor kort echter technieken die directe toegang tot cellen en isolatie van specifieke celtypen vereisen, kunnen niet worden toegepast in C. elegans. Deze beperking is te wijten aan het feit dat de weefsels worden ingesloten in een onder druk cuticula die niet gemakkelijk verteerd door behandeling met enzymen en / of reinigingsmiddelen. Gebaseerd op vroege pionierswerk door Laird Bloom, Christensen en collega's 1 ontwikkelde een robuuste methode voor het kweken van C. elegans embryonale cellen op grote schaal. Eieren worden geïsoleerd van zwangere volwassenen door behandeling met bleekwater / NaOH en vervolgens behandeld met chitinase om de eierschalen te verwijderen. Embryonale cellen worden vervolgens gedissocieerd door handmatig pipetteren en uitgeplaat op substraat bedekt glas in serum verrijkte media. Binnen 24 uur van isolatie cellen beginnen te differentiëren door het veranderen van de morfologie en expressie celspecifieke Markers. C. elegans cellen gekweekt met deze methode overleven gedurende 2 weken in vitro en zijn gebruikt voor elektrofysiologische, immunochemische, en imaging analyses als ze zijn gesorteerd en gebruikt voor microarray profilering.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtige modelorganisme voor het onderzoek naar de moleculaire basis van cellulaire functie, differentiatie, en gedrag. Terwijl het genoom, metabolische en biosynthetische routes lijken op gewervelde dieren, de genetische en moleculaire volgzaamheid veel groter 2. Onder de voordelen zijn de grootte en simpele anatomie, de snelle levenscyclus (3 dagen bij 25 ° C), korte levensduur (2 weken) en een groot aantal nakomelingen (> 200). Door zijn tweeslachtig karakter en de korte levenscyclus, moleculaire en genetische manipulaties zijn eenvoudig in C. elegans, inclusief de ontwikkeling van transgene dieren 3,4 en de toepassing van gen knock-down technieken zoals RNA interferentie 5. C. elegans lichaam en eierschaal transparant. Daarom cellen kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd in zowel de volwassenen en het embryo met standaard microscopie. In de afgelopen 40 jaar, de C. elegans </em> gemeenschap is van onschatbare waarde middelen gecreëerd voor C. elegans onderzoek met inbegrip van een grote verzameling van mutanten, knockouts en transgenics, een gedetailleerde beschrijving van de anatomie en ontwikkeling 6,7, inclusief de volledige reconstructie van het zenuwstelsel 8, en een volledig gesequenced genoom die goed geannoteerd en ter beschikking van de hele gemeenschap ( www.wormbase.com ).
Ondanks de vele voordelen, hebben sommige experimentele benaderingen uitdagend in C. elegans. Deze omvatten degenen die toegang vereisen het plasmamembraan van de cellen en isolatie van weefsels of celtypen. Inderdaad C. elegans weefsels worden beperkt binnen haar onder druk hydrostatisch skelet, die niet gemakkelijk wordt verteerd door enzymatische behandeling of detergenten. Aan het einde van de jaren 1990 Miriam Goodman en Janet Richmond pionier methoden voor elektrofysiologische opnames van C. elegansneuronen en spiercellen in situ 9,10. Hoewel deze methoden gaf ons belangrijke inzichten in neuronale en spierfunctie in vivo, ze zijn uitdagend en lage doorvoersnelheid. Alternatieve methoden voor celfunctie studeren in vivo waren ontwikkeld, vooral met name in vivo calcium beeldvorming met behulp van genetisch gecodeerd calcium sensoren zoals GCamP en cameleon 11-13. Deze methoden echter niet het gebruik van farmacologische hulpmiddelen staan omdat ze worden toegepast op intacte levende dieren.
De eerste poging tot het kweken van C. elegans cellen in vitro op grote schaal werd gemaakt door Laird Bloom tijdens de voorbereiding van zijn proefschrift 14. Helaas, moeilijkheden met slechte hechting van de cellen aan het substraat, slechte celdifferentiatie en overleving verhinderde de invoering van deze vroege protocol als een robuust celkweekwerkwijze. In 1995 Edgar en collega's een procedure gepubliceerdtot celdeling en morfogenese onderzoeken door isolatie en de cultuur van een enkele C. elegans embryo 15. Embryonale cellen verkregen door digestie van de eierschalen met een combinatie van enzymatische behandeling en handmatige dissociatie, bleven prolifereren, produceren tot ~ 500 cellen 15. Vervolgens Leung en collega's gekweekt een kleine aantallen blastomeres intestinale morfogenese bestuderen. Zij toonden aan dat een in vitro geïsoleerde E blastomeer geproduceerd gepolariseerde darmcellen die een structuur analoog aan de darmlumen door interactie met elkaar via apicale contactplaatsen 16. Buechner en collega's rapporteerden ook een soortgelijke methode voor het kweken C. elegans embryonale cellen in vitro 17.
Op basis van dit vroege werk, Christensen en collega's ontwikkelden een robuust protocol voor het kweken van embryonale C. elegans cellen in vitro 1. Zetoonde aan dat geïsoleerde C. elegans cellen kunnen differentiëren in verschillende celtypes en de functies die zij bezitten in vivo en het uiten van celspecifieke markers handhaven. Verschillende technieken die uitdagend in vivo kan worden toegepast op geïsoleerde C. elegans embryonale cellen. Deze omvatten elektrofysiologische 1,18 19, weergave en immunochemische technieken 20,21, en isolatie van specifieke celtypes TL-Activated Cell Sorting (FACS) voor de bouw van cel-specifieke cDNA-bibliotheken 22,23. Gene knockdown technieken zoals RNA interferentie (RNAi) kan worden aangebracht op gekweekte C. elegans cellen 1 en een nieuwe metabolische labeling met gebruik Azido-suiker als een instrument voor glycoproteïne ontdekking recent ontwikkeld in vitro gekweekte C. elegans cellen 24.
Tenslotte breidt de celkweek methode matrix of technieken die kunnen worden toegepast op de C. elegans model in een poging om genfunctie ontcijferen in de context van een levend organisme. We beschrijven hier het protocol voor het kweken van C. elegans embryonale cellen in vitro, die grotendeels is gebaseerd op het protocol eerst beschreven door Christiansen en collega 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans is een krachtige modelorganisme voor het ontcijferen van de genetische wegen betrokken bij de ontwikkeling, het gedrag en veroudering. Het gemak is voornamelijk het gevolg van het gemak waarmee het genetisch gemanipuleerd kan worden en uit zijn korte levenscyclus. Ondanks het gemak, C. elegans heeft zijn beperkingen. C. elegans cellen zijn klein en ingesloten in een onder druk cuticula dat de toepassing van methoden die directe toegang tot de cellen, zoals elektrofysiologische en fa…
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
References
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. . Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. 유전학. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
