Un procédé de culture embryonnaire<em> C. elegans</em> Cellules
Summary
Nous décrivons ici un protocole révisé pour la culture à grande échelle de l'embryon C. elegans cellules. Embryonnaire C. elegans cellules cultivées in vitro à l'aide de cette méthode, semblent différencier récapituler et l'expression de gènes d'une manière spécifique de la cellule. Les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules ou à l'isolement de types de cellules spécifiques à partir d'autres tissus peuvent être appliquées sur C. elegans cellules cultivées.
Abstract
C. elegans est un puissant système de modèle, dans lequel des techniques génétiques et moléculaires sont facilement applicables. Jusqu'à récemment, cependant, les techniques qui nécessitent un accès direct à des cellules et l'isolement de types cellulaires spécifiques, ne pouvaient pas être appliquées dans C. elegans. Cette limitation est due au fait que les tissus sont confinés à l'intérieur d'une cuticule sous pression qui n'est pas facilement digéré par traitement avec des enzymes et / ou des détergents. Basé sur les premiers travaux de pionnier par Laird Bloom, Christensen et ses collègues 1 développé une méthode robuste pour la culture de C. elegans cellules embryonnaires à grande échelle. Les oeufs sont isolés des adultes gravides par traitement avec l'eau de Javel / NaOH et ensuite traitées avec chitinase pour enlever les coquilles. Les cellules embryonnaires sont alors dissociées par pipetage manuel et étalées sur substrat de verre recouvert dans les médias de sérum enrichi. Dans les 24 heures de cellules d'isolement commencer à se différencier en changeant la morphologie et en exprimant Marke spécifique de cellulers. C. elegans cellules cultivées en utilisant cette méthode survivre jusqu'à deux semaines in vitro et ont été utilisés pour électrophysiologique, immunochimique, et l'imagerie des analyses aussi bien qu'ils ont été triés et utilisés pour microarray profilage.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme modèle puissant pour l'étude des bases moléculaires de la fonction cellulaire, la différenciation et le comportement. Alors que son génome, les voies métaboliques et biosynthétiques sont similaires chez les vertébrés », sa traçabilité génétique et moléculaire sont beaucoup plus 2. Parmi ses avantages sont sa taille et simple anatomie, son cycle de vie rapide (3 jours à 25 ° C), durée de vie courte (2 semaines) et un grand nombre de descendants (> 200). En raison de sa nature hermaphrodite et cycle de vie court, les manipulations génétiques et moléculaires sont simples dans C. elegans, y compris la génération d'animaux transgéniques 3,4 et l'application de techniques de knock-down gènes tels que l'ARN interférence 5. C. corps et la coquille elegans sont transparents. Par conséquent les cellules peuvent être facilement visualisés à la fois l'adulte et l'embryon au microscope standard. Au cours des 40 dernières années, le C. elegans </em> communauté a créé des ressources inestimables pour C. recherche elegans notamment une grande collection de mutants, KO et transgéniques, une description détaillée de l'anatomie et de développement 6,7, y compris la reconstruction complète du système nerveux 8, et un génome entièrement séquencé qui est bien annoté et disponible à toute la communauté ( www.wormbase.com ).
Malgré les nombreux avantages, certaines approches expérimentales ont été difficiles en C. elegans. Ceux-ci comprennent ceux qui nécessitent l'accès à la membrane plasmique des cellules et l'isolement des tissus ou types cellulaires. En effet C. elegans tissus sont confinés à l'intérieur de son squelette hydrostatique sous pression, qui n'est pas facilement digéré par traitement enzymatique ou détergents. À la fin de 1990 Miriam Goodman et Janet Richmond pionnier des méthodes pour les enregistrements électrophysiologiques C. elegansles neurones et les cellules musculaires in situ 9,10. Bien que ces méthodes nous ont donné des informations importantes sur neuronale et la fonction musculaire in vivo, ils sont difficiles et à faible débit. Des méthodes alternatives pour étudier la fonction des cellules in vivo ont été développés, notamment dans la plupart imagerie calcique in vivo en utilisant des capteurs de calcium génétiquement codés comme GCamP et cameleon 11-13. Ces méthodes cependant, ne permettent pas l'utilisation d'outils pharmacologiques parce qu'ils sont appliqués sur des animaux vivants intacts.
La première tentative de culture C. cellules elegans in vitro à grande échelle a été faite par Laird Bloom lors de la préparation de sa thèse de doctorat 14. Malheureusement, les difficultés rencontrées avec une mauvaise adhérence des cellules sur le substrat, la différenciation cellulaire et la survie médiocre ont empêché la mise en place de ce protocole rapide comme un procédé de culture cellulaire robuste. En 1995, Edgar et ses collègues ont publié une procédurepour enquêter sur la division cellulaire et de la morphogenèse par l'isolement et la culture d'un seul C. elegans embryons 15. Les cellules embryonnaires obtenues par digestion des coquilles d'œufs avec une combinaison de traitement enzymatique et la dissociation d'emploi, ont continué à proliférer, produisant jusqu'à ~ 500 cellules 15. Par la suite, Leung et collègues cultivées un petit nombre de blastomères d'étudier la morphogenèse intestinale. Ils ont montré que in vitro une blastomère isolé E produite cellules intestinales polarisées qui ont créé une structure analogue à celle de la lumière intestinale par l'interaction avec l'autre à travers les jonctions adhérentes apical 16. Buechner et ses collègues ont également fait état d'une méthode similaire pour la culture C. elegans cellules embryonnaires in vitro 17.
Sur la base de ces premiers travaux, Christensen et ses collègues ont développé un protocole robuste pour la culture embryonnaire C. elegans cellules in vitro 1. Ilsa montré que C isolé. elegans cellules peuvent se différencier en différents types de cellules et de maintenir les caractéristiques qu'ils possèdent in vivo, y compris l'expression de marqueurs spécifiques des cellules. Plusieurs techniques qui sont difficiles in vivo, peuvent être appliqués sur isolé C. elegans cellules embryonnaires. Il s'agit notamment de 1,18 19 électrophysiologique, l'imagerie et les techniques immunochimiques 20,21, ainsi que l'isolement de types de cellules spécifiques par cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour la construction de banques d'ADNc spécifiques de cellules 22,23. techniques de knock-down de gènes tels que l'ARN interférence (ARNi) peuvent être appliqués sur cultivées C. elegans cellules 1 et une méthode de marquage métabolique roman utilisant azido-sucre comme un outil pour la découverte de la glycoprotéine a été récemment développé pour in vitro en culture C. elegans cellules 24.
En conclusion, le procédé de culture de cellules élargit la gamme of techniques qui peuvent être appliquées à l'C. modèle elegans dans un effort pour déchiffrer la fonction des gènes dans le contexte d'un organisme vivant. Nous décrivons ici le protocole pour la culture de C. elegans cellules embryonnaires in vitro, qui est en grande partie basée sur le premier protocole décrit par Christiansen et ses collègues 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans est un organisme modèle puissant pour déchiffrer les voies génétiques impliqués dans le développement, le comportement et le vieillissement. Sa commodité provient principalement de la facilité avec laquelle il peut être manipulé génétiquement et de son cycle de vie court. Malgré sa commodité, C. elegans a ses limites. C. cellules elegans sont minuscules et confinée à l'intérieur d'une cuticule sous pression qui limite l'application des procédé…
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
References
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