संवर्धन भ्रूण के लिए एक विधि<em> सी. एलिगेंस</em> कक्ष
Summary
हम भ्रूण सी. के बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए यहां एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन कोशिकाओं एलिगेंस. भ्रूण सी. एलिगेंस इस पद्धति का उपयोग इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं, एक सेल विशिष्ट तरीके में जीन की अभिव्यक्ति अंतर और पुनरावृत्ति दिखाई देते हैं. प्रत्यक्ष कोशिकाओं के लिए उपयोग या अन्य ऊतकों से विशेष प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता है कि तकनीक सी. पर लागू किया जा सकता है संवर्धित कोशिकाओं एलिगेंस.
Abstract
एलिगेंस आनुवंशिक और आणविक तकनीक आसानी से लागू कर रहे हैं, जिसमें एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली, है. अभी हाल तक, हालांकि, कोशिकाओं और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव के लिए सीधी पहुँच की आवश्यकता है कि तकनीक, सी में लागू नहीं किया जा सकता है एलिगेंस. इस सीमा के ऊतकों आसानी से एंजाइम और / या डिटर्जेंट के साथ इलाज के द्वारा पच नहीं रहा है जो एक दबाव छल्ली भीतर ही सीमित हैं कि इस तथ्य के कारण किया गया था. ठाकुर ब्लूम, क्रिस्टेनसेन और 1 सी. संवर्धन के लिए एक मजबूत विधि विकसित सहयोगियों द्वारा प्रारंभिक अग्रणी काम के आधार पर बड़े पैमाने में भ्रूण कोशिकाओं एलिगेंस. अंडे ब्लीच / NaOH के साथ इलाज के द्वारा गर्भवती वयस्कों से अलग किया और बाद में अनावश्यक कार्य को दूर करने के chitinase के साथ व्यवहार कर रहे हैं. भ्रूण कोशिकाओं फिर पुस्तिका pipetting द्वारा अलग और सीरम समृद्ध मीडिया में सब्सट्रेट से ढके कांच पर चढ़ाया जाता है. अलगाव कोशिकाओं के 24 घंटे के भीतर आकृति विज्ञान बदलकर और सेल विशिष्ट marke व्यक्त करके अलग करने के लिए शुरूरुपये. सी. एलिगेंस इस पद्धति का उपयोग संवर्धित कोशिकाओं इन विट्रो में 2 सप्ताह के लिए जीवित रहते हैं और electrophysiological, immunochemical के लिए इस्तेमाल किया गया है, और वे क्रमबद्ध और माइक्रोएरे रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया गया है के रूप में इमेजिंग के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण करती है.
Introduction
Caenorhabditis एलिगेंस (सी एलिगेंस) सेलुलर समारोह, भेदभाव, और व्यवहार के आणविक ठिकानों की जांच के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव है. इसके जीनोम, चयापचय और biosynthetic रास्ते रीढ़ 'के समान हैं, इसके आनुवंशिक और आणविक शिक्षणीयता 2 तक अधिक से अधिक कर रहे हैं. अपने फायदे के अलावा इसका आकार और सरल शरीर रचना, अपनी तेजी से जीवन चक्र (25 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन), कम जीवन अवधि (2 सप्ताह) और वंश की बड़ी संख्या (> 200) हैं. कारण इसकी उभयलिंगी प्रकृति और कम जीवन चक्र को, आणविक और आनुवंशिक जोड़तोड़ सी. में सीधा कर रहे हैं ट्रांसजेनिक जानवर 3,4 और ऐसे शाही सेना के हस्तक्षेप के रूप में 5 जीन दस्तक नीचे तकनीक के इस्तेमाल की पीढ़ी सहित एलिगेंस,. सी. एलिगेंस शरीर और खोल पारदर्शी हैं. इसलिए कोशिकाओं को आसानी से वयस्क और मानक माइक्रोस्कोपी का उपयोग भ्रूण दोनों में देखे जा सकते हैं. पिछले 40 वर्षों में, सी. एलिगेंस </उन्हें> समुदाय सी. के लिए अमूल्य संसाधन बनाया गया है म्यूटेंट, knockouts और ट्रांसजेनिक्स का एक बड़ा संग्रह, तंत्रिका तंत्र 8 से भरा पुनर्निर्माण सहित शरीर रचना और विकास 6,7 की एक विस्तृत विवरण, और अच्छी तरह से एनोटेट और पूरे समुदाय के लिए उपलब्ध है जो एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम (सहित एलिगेंस अनुसंधान www.wormbase.com ).
कई फायदे के बावजूद, कुछ प्रयोगात्मक दृष्टिकोण सी. में चुनौती देने के लिए किया गया है एलिगेंस. इन ऊतकों या सेल प्रकार की कोशिकाओं और अलगाव के प्लाज्मा झिल्ली तक पहुँच की आवश्यकता है कि लोगों में शामिल हैं. दरअसल सी. एलिगेंस ऊतकों आसानी एंजाइमी उपचार या डिटर्जेंट से पचता नहीं है जो अपने दबाव हीड्रास्टाटिक कंकाल, भीतर ही सीमित हैं. 1990 के दशक के अंत में मरियम गुडमैन और जेनेट रिचमंड सी. के electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तरीके का बीड़ा उठाया एलिगेंससीटू 9,10 में न्यूरॉन्स और मांसपेशियों की कोशिकाओं. इन तरीकों हमें neuronal और इन विवो में पेशी समारोह में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि दे दी है, वे चुनौतीपूर्ण और कम throughput हैं. विवो में सेल समारोह का अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक तरीकों ज़्यादातर विशेष रूप से इस तरह के GCamP और Cameleon 11-13 के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम सेंसर का उपयोग विवो कैल्शियम इमेजिंग में विकसित किया गया था. वे अक्षुण्ण रहने वाले जानवरों पर लागू कर रहे हैं क्योंकि इन विधियों हालांकि, औषधीय उपकरणों के उपयोग की अनुमति नहीं है.
संवर्धन सेल्सियस पर पहला प्रयास बड़े पैमाने पर इन विट्रो में एलिगेंस कोशिकाओं अपनी पीएचडी थीसिस 14 की तैयारी के दौरान ठाकुर ब्लूम द्वारा किया गया था. दुर्भाग्य से, कठिनाइयों सब्सट्रेट करने के लिए कक्षों की गरीब आसंजन के साथ सामना करना पड़ा, गरीब सेल भेदभाव और अस्तित्व के एक मजबूत सेल संस्कृति पद्धति के रूप में इस प्रारंभिक प्रोटोकॉल की स्थापना को रोका. 1995 में एडगर और उनके सहयोगियों ने एक प्रक्रिया प्रकाशितएक सी के अलगाव और संस्कृति से कोशिका विभाजन और morphogenesis जांच करने के लिए. एलिगेंस 15 भ्रूण. एंजाइमी उपचार और मार्गदर्शन हदबंदी के संयोजन के साथ अनावश्यक कार्य की पाचन द्वारा प्राप्त भ्रूण कोशिकाओं, ~ 500 कोशिकाओं 15 तक उत्पादन, पैदा करना जारी रखा. बाद में, Leung और सहकर्मियों आंतों morphogenesis अध्ययन करने के लिए blastomeres की एक छोटी संख्या सुसंस्कृत. वे एक में इन विट्रो अलग ई प्रसूखण्ड शिखर adherens जंक्शनों 16 के माध्यम से एक दूसरे के साथ बातचीत से आंतों लुमेन के अनुरूप संरचना बनाए गए ध्रुवीकृत आंतों की कोशिकाओं का उत्पादन दिखाया. Buechner और उनके सहयोगियों ने भी संवर्धन सी के लिए एक समान विधि की सूचना दी. इन विट्रो 17 में भ्रूण कोशिकाओं एलिगेंस.
इस प्रारंभिक काम के आधार पर, क्रिस्टेनसेन और उनके सहयोगियों ने भ्रूण सी संवर्धन के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल विकसित की है. एलिगेंस विट्रो 1 में कोशिकाओं. वेकि पृथक सी दिखाया. एलिगेंस कोशिकाओं विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अंतर और सेल विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति सहित वे विवो में अधिकारी है कि सुविधाओं, बनाए रख सकते हैं. विवो में चुनौती दे रहे हैं कि कई तकनीकों, पृथक सी. पर लागू किया जा सकता है भ्रूण कोशिकाओं एलिगेंस. ये electrophysiological 1,18 19, इमेजिंग, और immunochemical तकनीक 20,21, साथ ही सेल विशिष्ट सीडीएनए पुस्तकालयों 22,23 के निर्माण के लिए छंटनी (FACS) फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल द्वारा विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के अलगाव में शामिल हैं. ऐसे शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) के रूप में जीन पछाड़ना तकनीक सुसंस्कृत सी. पर लागू किया जा सकता है एलिगेंस कोशिकाओं 1 और ग्लाइकोप्रोटीन की खोज के लिए एक उपकरण के रूप में azido चीनी का उपयोग कर एक उपन्यास चयापचय लेबलिंग विधि हाल ही में इन विट्रो सुसंस्कृत सी. के लिए विकसित किया गया है एलिगेंस कोशिकाओं 24.
अंत में, सेल संस्कृति विधि सरणी ओ फैलतासी. करने के लिए लागू किया जा सकता है कि एफ तकनीक एक जीवित जीव के संदर्भ में जीन समारोह को समझने के प्रयास में एलिगेंस मॉडल. हम सी. संवर्धन के लिए यहाँ प्रोटोकॉल का वर्णन मोटे तौर पर पहले ईसाई और उनके सहयोगियों ने 1 से वर्णित प्रोटोकॉल पर आधारित है जो इन विट्रो में भ्रूण कोशिकाओं एलिगेंस.
Protocol
Representative Results
Discussion
एलिगेंस विकास, व्यवहार और बुढ़ापे में शामिल आनुवंशिक रास्ते गूढ़ रहस्य के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव है. अपनी सुविधा के लिए मुख्य रूप से यह आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ की जा सकती है जिसके साथ आसानी से औ?…
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
References
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