Un metodo per la coltura embrionale<em> C. elegans</em> Celle
Summary
Descriviamo qui un protocollo riveduto per la cultura su larga scala di embrionale C. elegans cellule. Embryonic C. elegans cellule coltivate in vitro utilizzando questo metodo, sembrano differenziare e ricapitolare l'espressione di geni in maniera specifica cella. Tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule o l'isolamento di specifici tipi cellulari da altri tessuti possono essere applicati su C. elegans cellule in coltura.
Abstract
C. elegans è un potente sistema modello, in cui le tecniche genetiche e molecolari sono facilmente applicabili. Fino a poco tempo però, tecniche che richiedono l'accesso diretto alle cellule e isolamento di specifici tipi cellulari, potrebbero non essere applicate in C. elegans. Questa limitazione è dovuta al fatto che i tessuti sono confinati all'interno di una cuticola pressurizzato che non è facilmente digeribile mediante trattamento con enzimi e / o detergenti. Basata su lavoro di pioniere da Laird Bloom, Christensen e colleghi 1 sviluppato un metodo affidabile per la coltura di C. elegans cellule embrionali in larga scala. Le uova sono isolati dagli adulti gravide mediante trattamento con candeggina / NaOH e successivamente trattati con chitinase per rimuovere i gusci d'uovo. Le cellule embrionali sono poi dissociate da pipettaggio manuale e piastrati su substrato di vetro ricoperto nei media siero arricchito. Entro 24 ore di celle di isolamento cominciare a differenziare cambiando la morfologia ed esprimendo cellule marke specificars. C. elegans cellule coltivate utilizzando questo metodo sopravvivono superiore 2 settimane in vitro e sono stati utilizzati per elettrofisiologica, immunochimici, imaging analisi così come sono state filtrate e utilizzati per microarray profiling.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un potente organismo modello per studiare le basi molecolari della funzione cellulare, differenziamento, e il comportamento. Mentre il suo genoma, vie metaboliche e biosintetiche sono simili ai vertebrati ', la sua trattabilità genetica e molecolare sono di gran lunga maggiore 2. Tra i suoi vantaggi sono la sua dimensione e semplice anatomia, il suo rapido ciclo di vita (3 giorni a 25 ° C), di breve durata (2 settimane) e il gran numero di figli (> 200). Grazie alla sua natura ermafrodita e breve ciclo di vita, manipolazioni molecolari e genetici sono semplici in C. elegans, compresa la generazione di animali transgenici 3,4 e l'applicazione di tecniche di gene irrisori come RNA interference 5. C. corpo elegans e guscio d'uovo sono trasparenti. Pertanto cellule possono essere facilmente visualizzati sia l'adulto e l'embrione utilizzando microscopia standard. Negli ultimi 40 anni, il C. elegans </em> comunità ha creato risorse preziose per C. ricerca elegans cui una grande raccolta di mutanti, ko e transgenici, una descrizione dettagliata di anatomia e sviluppo 6,7, compresa la completa ricostruzione del sistema nervoso 8, e un genoma completamente sequenziato che è ben annotato e disponibile per tutta la comunità ( www.wormbase.com ).
Nonostante i numerosi vantaggi, alcuni approcci sperimentali sono stati difficili in C. elegans. Questi includono quelli che richiedono l'accessibilità alla membrana plasmatica delle cellule e l'isolamento di tessuti o tipi cellulari. Infatti C. tessuti elegans sono confinate all'interno della sua pressione scheletro idrostatico, che non è facilmente digerito dal trattamento enzimatico o detergenti. Alla fine degli anni 1990 Miriam Goodman e Janet Richmond pionieri metodi di registrazioni elettrofisiologiche di C. elegansneuroni e cellule muscolari in situ 9,10. Mentre questi metodi ci ha dato importanti intuizioni neuronale e la funzione muscolare in vivo, sono impegnativi e bassa velocità. Erano stati sviluppati metodi alternativi per studiare la funzione delle cellule in vivo, per lo più in particolare nel calcio di imaging in vivo utilizzando sensori di calcio geneticamente codificato come GCamP e cameleon 11-13. Questi metodi, però, non consentono l'utilizzo di strumenti farmacologici poiché applicati su animali viventi intatti.
Il primo tentativo di coltura C. elegans cellule in vitro in grande scala è stata fatta da Laird Bloom durante la preparazione della sua tesi di dottorato di ricerca 14. Purtroppo, le difficoltà incontrate con scarsa adesione delle cellule al substrato, la differenziazione cellulare e la sopravvivenza povero impedito la creazione di questo protocollo presto come metodo di coltura cellulare robusto. Nel 1995 Edgar e colleghi hanno pubblicato una proceduraper indagare la divisione cellulare e la morfogenesi da isolamento e la coltura di una singola C. elegans embrioni 15. Cellule embrionali ottenuti per digestione dei gusci d'uovo con una combinazione di trattamento enzimatico e dissociazione manuale, hanno continuato a proliferare, producendo fino a ~ 500 celle 15. Successivamente, Leung e collaboratori hanno coltivato un piccolo numero di blastomeri di studiare morfogenesi intestinale. Essi hanno dimostrato che uno vitro isolato E blastomere prodotta in cellule intestinali polarizzate che ha creato una struttura analoga a lume intestinale interagendo tra loro attraverso adherens apicali svincoli 16. Buechner e colleghi hanno anche segnalato un metodo simile per la coltura C. elegans cellule embrionali in vitro 17.
Sulla base di questo primo lavoro, Christensen e colleghi hanno sviluppato un protocollo robusto per la coltura embrionale C. elegans cellule in vitro 1. Essiha dimostrato che isolato C. elegans cellule possono differenziarsi in vari tipi di cellule e preservare le caratteristiche che possiedono in vivo, compresa l'espressione di marcatori cellula-specifici. Diverse tecniche che sono impegnativi in vivo, possono essere applicati su isolato C. elegans cellule embrionali. Questi includono elettrofisiologico 1,18 19, imaging e tecniche immunochimiche 20,21, così come l'isolamento di specifici tipi cellulari da cellule fluorescenti-Activated (FACS) per la costruzione di librerie di cDNA cellula-specifici 22,23. Gene knockdown tecniche come RNA interference (RNAi) possono essere applicati su coltura C. elegans celle 1 e un metodo di marcatura metabolica romanzo utilizzando Azido zucchero come strumento per la scoperta glicoproteina è stato recentemente sviluppato per C. coltivate in vitro elegans cellule 24.
In conclusione, il metodo di coltura cellulare espande la matrice of tecniche che possono essere applicate al C. modello elegans nel tentativo di decifrare funzione genica nel contesto di un organismo vivente. Descriviamo qui il protocollo per la coltura di C. elegans cellule embrionali in vitro, che è in gran parte basata sul protocollo prima descritto da Christiansen e colleghi 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans è un potente organismo modello per decifrare i meccanismi genetici coinvolti nello sviluppo, il comportamento e l'invecchiamento. La sua convenienza deriva principalmente dalla facilità con cui può essere geneticamente manipolato e dal suo ciclo di vita breve. Nonostante la sua convenienza, C. elegans ha i suoi limiti. C. elegans cellule sono minuscole e confinato all'interno di una cuticola pressurizzata che limita l'applicazione di metodi che richiedono l'access…
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
References
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