Метод для культивирования эмбриональных<em> С. Элеганс</em> Клетки
Summary
Мы описываем здесь пересмотренный протокол для крупномасштабного культуры эмбриональных С. Элеганс клетки. Эмбриональные С. Элеганс клетки, культивируемые в лабораторных, используя этот метод, по-видимому, дифференцировать и резюмировать экспрессию генов в определенном порядке клеток. Методы, которые требуют прямого доступа к клеткам или изоляцию специфические типы клеток из других тканей можно применять на С. Элеганс культивируемых клеток.
Abstract
С. Элеганс является мощным модель системы, в которой генетические и молекулярные методы легко применимы. До недавнего времени не менее, методы, которые требуют прямой доступ к клеткам и выделения специфических типов клеток, не могли быть применены в C. Элеганс. Это ограничение было связано с тем, что ткани заключены внутри герметичной кутикулы, которое не легко переваривается обработкой ферментами и / или моющих средств. Основываясь на ранней пионерской работе по Laird Блум, Кристенсен и его коллеги 1 разработали надежный метод для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в больших масштабах. Яйца изолированы от беременных взрослых путем обработки отбеливающей / NaOH и затем обрабатывали хитиназы, чтобы удалить скорлупы. Эмбриональные клетки затем диссоциирует с помощью ручного пипетки и помещают на подложки, покрытые стеклом в сыворотке крови, обогащенной средах. В 24 часов в одиночных камерах начинают дифференцироваться путем изменения морфологии и, выражая определенную Marke клетокRS. C. Элеганс-клетки, культивируемые с помощью этого метода выживать в течение 2 недель в пробирке и были использованы для электрофизиологических, иммунохимическими и визуализации анализа, а также они были отсортированы и используется для микрочипов профилирования.
Introduction
Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) является мощным модельным организмом для изучения молекулярных основ клеточной функции, дифференциации и поведения. В то время как его геном, метаболические и биосинтеза похожи на позвоночных », его генетических и молекулярных уступчивость гораздо больше 2. Среди его преимуществ являются его размер и простой анатомии, его быстрый цикл жизни (3 дней при 25 ° С), короткий срок службы (2 недели) и большое количество потомства (> 200). Благодаря своей гермафродитного природы и коротким жизненным циклом, молекулярные и генетические манипуляции просты в С. Элеганс, в том числе получения трансгенных животных 3,4 и применения генных методов бросовым таких как РНК-интерференция 5. С. Элеганс тело и яичной скорлупы прозрачны. Поэтому клетки могут быть легко визуализированы как в взрослых и эмбриона с помощью стандартного микроскопии. В последние 40 лет, С. Элеганс </EM> сообщество создало бесценные ресурсы для C. Исследование Элеганс в том числе большой коллекции мутантов, врезками и трансгенных, подробное описание анатомии и развития 6,7, в том числе полная реконструкция нервной системы 8, и полностью секвенированных генома, которая хорошо аннотированный и доступной для всего сообщества ( www.wormbase.com ).
Несмотря на многочисленные преимущества, некоторые экспериментальные подходы, создают большие сложности в С. Элеганс. К ним относятся те, которые требуют доступ к плазматической мембране клеток и тканей изоляции или типов клеток. Действительно C. Elegans ткани заключены внутри ее под давлением гидростатического скелета, которое не легко переваривается ферментативной обработкой или моющих средств. В конце 1990-х годов Мириам Гудман и Джанет Ричмонд впервые методы электрофизиологических записей С. Элеганснейроны и мышечные клетки в месте 9,10. Хотя эти методы дали нам важную информацию о нейронных и функции мышц в естественных условиях, они являются сложными и низкая пропускная. Альтернативные методы для изучения функции клеток в естественных условиях была разработана, в основном в частности, в естественных изображений кальция с использованием генетически закодированные датчики кальция, такие как GCamP и Cameleon 11-13. Эти методы не менее, не позволяют использование фармакологических средств, так как они применяются на интактных живых животных.
Первая попытка культивирования C. Элеганс клетки в пробирке в больших масштабах выступил Laird Блум в ходе подготовки своей диссертации 14. К сожалению, трудности, возникающие с плохой адгезии клеток к подложке, плохое дифференцировка клеток и выживание предотвратить создание этой ранней протокола как надежного метода культуры клеток. В 1995 году Эдгар и его коллеги опубликовали процедуруисследовать деление клеток и морфогенеза путем выделения и культуры одного C. Элеганс эмбрионов 15. Эмбриональные клетки, полученные путем гидролиза из яичной скорлупы с комбинацией ферментативной обработки и ручной диссоциации, продолжали размножаться, производя до ~ 500 клеток 15. Впоследствии Леунг и его коллеги культивировали небольшие количества бластомеров для изучения кишечной морфогенез. Они показали, что один в пробирке изолированные E бластомер производится поляризованные клетки кишечника, которые создали структуру, аналогичную просвет кишечника, взаимодействуя друг с другом через верхушечных слипчивых соединений 16. Бюхнер и его коллеги также сообщили подобный метод для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в пробирке 17.
Основываясь на этой ранней работы, Кристенсен и его коллеги разработали надежную протокол для культивирования эмбриональных C. Элеганс клетки в пробирке 1. Онипоказали, что изолированные C. Элеганс клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток и поддерживать функции, которыми они обладают в естественных условиях, в том числе экспрессию маркеров для соты. Некоторые методы, которые являются сложными в естественных условиях, могут быть применены на изолированных С. Элеганс эмбриональные клетки. К ним относятся электрофизиологические 1,18 19 изображений, и иммунохимических методов 20,21, а также изоляцию специфические типы клеток флуоресцентным-Активированный сортировки клеток (FACS) для строительства клеточных конкретных библиотек кДНК 22,23. Генные нокдаун методы, такие как РНК-интерференция (RNAi) может быть применен на культивируемой С. Элеганс клетки 1 и роман метаболический метод маркировки с помощью Азидо-сахар в качестве инструмента для открытия гликопротеина недавно был разработан для в пробирке культурного C. Элеганс клетки 24.
В заключение, метод культуры клеток расширяет массив Oе методы, которые могут быть применены к С. Элеганс модель в попытке расшифровать функции генов в контексте живой организм. Мы описываем здесь протокол для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в пробирке, которая в значительной степени на основе протокола, впервые описанным Кристиансен и 1 коллегами.
Protocol
Representative Results
Discussion
С. Элеганс является мощным модельным организмом для расшифровки генетических путей, участвующих в разработке, поведения и старения. Ее удобство происходит, главным образом от той легкости, с которой он может быть генетически манипулировать и от его короткого жизненного цикла. Нес…
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
References
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. . Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. 유전학. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
