En metod för odling av embryonala<em> C. elegans</em> Celler
Summary
Vi beskriver här ett reviderat protokoll för storskalig odling av embryonala C. elegans-celler. Embryonala C. elegans-celler odlade in vitro med användning av denna metod verkar att differentiera och rekapitulera uttrycket av gener i ett cellspecifikt sätt. Tekniker som kräver direkt tillgång till cellerna eller isolering av specifika celltyper från andra vävnader kan tillämpas på C. elegans odlade celler.
Abstract
C. elegans är en kraftfull modellsystem, i vilka genetiska och molekylära metoder är lätta att tillämpa. Fram till helt nyligen men tekniker som kräver direkt tillgång till celler och isolering av specifika celltyper, kunde inte tillämpas i C. elegans. Denna begränsning beror på det faktum att vävnaderna är begränsade till en trycksatt nagelband som inte är lättsmält genom behandling med enzymer och / eller detergenter. Baserat på tidiga pionjärarbete från Laird Bloom, Christensen och kollegor 1 utvecklat en robust metod för odling av C. elegans embryonala celler i stor skala. Ägg är isolerade från gravida vuxna genom behandling med blekmedel / NaOH och därefter behandlas med chitinas att ta bort äggskal. Embryonala celler sedan dissocieras genom manuell pipettering och ströks ut på substrattäckta glas i serumberikat medium. Inom 24 timmar av isoleringsceller börjar differentiera genom att ändra morfologi och genom att uttrycka cellspecifika Markers. C. elegans celler odlade med hjälp av denna metod överleva i upp 2 veckor in vitro och har använts för elektrofysiologiska, immun och bildhantering analyser samt de har sorterats och används för microarray profilering.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en kraftfull modellorganism för att undersöka de molekylära grunderna för cellulär funktion, differentiering, och beteende. Medan dess genom, metabola och biosyntetiska vägar liknar ryggradsdjur ", dess genetiska och molekylär spårbarhet är mycket större 2. Bland dess fördelar är dess storlek och enkel anatomi, dess snabba livscykel (3 dagar vid 25 ° C), kort livslängd (2 veckor) och ett stort antal avkommor (> 200). På grund av sin hermafroditiska natur och kort livscykel, molekylära och genetiska manipulationer är enkla i C. elegans, även produktion av transgena djur 3,4 och tillämpningen av gen knock-down tekniker såsom RNA-interferens 5. C. elegans kropp och äggskal är transparenta. Därför celler kan enkelt visualiseras i både vuxna och embryot med standard mikroskopi. Under de senaste 40 åren, i C. elegans </em> samfundet har skapat ovärderliga resurser för C. elegans forskning inklusive en stor samling av mutanter, knockouts och transgena, en detaljerad beskrivning av anatomi och utveckling 6,7, inklusive fullständig återuppbyggnad av nervsystemet 8, samt ett helt sekvens genomet som är väl kommenterad och tillgänglig för hela samhället ( www.wormbase.com ).
Trots de många fördelar, har en del experimentella metoder varit utmanande i C. elegans. Dessa inkluderar de som kräver tillgång till plasmamembranet i cellerna och isolering av vävnader eller celltyper. Indeed C. elegans vävnader är begränsade till sin tryckhydrostatiskt skelett, som inte är lättsmält genom enzymatisk behandling eller rengöringsmedel. I slutet av 1990-talet Miriam Goodman och Janet Richmond pionjärer metoder för elektrofysiologiska inspelningar av C. elegansnervceller och muskelceller i situ 9,10. Även om dessa metoder gav oss viktiga insikter i neuronal-och muskelfunktion in vivo, de är utmanande och låg genomströmning. Alternativa metoder för att studera cellfunktionen in vivo hade utvecklats, mestadels särskilt in vivo kalcium avbildning med genetiskt kodade kalcium sensorer såsom GCamP och came 11-13. Dessa metoder dock inte tillåta användning av farmakologiska verktyg, eftersom de tillämpas på intakta levande djur.
Det första försöket vid odling C. elegans celler in vitro i stor skala gjordes av Laird Bloom under utarbetandet av sin doktorsavhandling 14. Tyvärr, svårigheter med dålig vidhäftning av cellerna till underlaget, dålig celldifferentiering och överlevnad hindrade etableringen av denna tidiga protokoll som en robust cellodlingsmetod. 1995 Edgar och kollegor publicerade ett förfarandeatt undersöka celldelning och morfogenes av isolering och odling av en enda C. elegans embryon 15. Embryoceller erhållna genom digerering av äggskal med en kombination av enzymatisk behandling och manuell dissociation fortsatte att föröka sig och att producera upp till ca 500 celler 15. Därefter Leung och medarbetare odlade ett litet antal blastomerer att studera tarm morfogenes. De visade att en in vitro isolerade E blastomere producerade polarisetarmceller som skapade en struktur analog med tarmlumen genom att interagera med varandra genom apikala adherensgränssnitten junctions 16. Buechner och kollegor rapporterade också en liknande metod för odling C. elegans embryoceller in vitro 17.
Baserat på detta tidiga arbete, Christensen och kollegor utvecklat en robust protokoll för odling av embryonala C. elegans-celler in vitro 1. Devisade att isolerade C. elegans celler kan differentiera till olika celltyper och upprätthålla de funktioner som de besitter in vivo, inklusive uttrycket av cellspecifika markörer. Flera tekniker som utmanar in vivo, kan tillämpas på enstaka C. elegans embryonala celler. Dessa inkluderar elektro 1,18 19, bildbehandling, och immunkemiska metoder 20,21, samt isolering av specifika celltyper genom Lysrör-Aktivt cellsortering (FACS) för byggande av cellspecifika cDNA-bibliotek 22,23. Gen knockdown tekniker såsom RNA-interferens (RNAi) kan appliceras på odlade C. elegans-celler 1 och en ny metabolisk märkningsmetod med användning av azido-socker som ett verktyg för glykoprotein upptäckt har nyligen utvecklats för att in vitro odlad C. elegans-celler 24.
Sammanfattningsvis expanderar cellodlingsmetod arrayen of tekniker som kan tillämpas på C. elegans modell i ett försök att dechiffrera geners funktion i samband med en levande organism. Vi beskriver här protokollet för odling av C. elegans embryonala celler in vitro, som till stor del bygger på protokoll som först beskrevs av Christiansen och kollegor 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans är en kraftfull modell organism för att dechiffrera den genetiska vägar som är involverade i utveckling, beteende och åldrande. Dess bekvämlighet härrör främst från den lätthet med vilken den kan vara genetiskt manipulerade och från sin korta livscykel. Trots sin bekvämlighet, C. elegans har sina begränsningar. C. elegans celler är liten och innesluten i en trycksatt nagelband som begränsar tillämpningen av metoder som kräver direkt tillgång till cellerna, t.ex. e…
Materials
| REAGENTS | |||
| Bacto Peptone | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco Agar Granulated | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto Tryptone | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto Yeast Extract | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N’,N’- tetraacidic acid (EGTA) | Sigma | E0396-25G | |
| Hepes | Sigma | H3375-500G | |
| Cholesterol | |||
| NaCl | Sigma | 57653-1KG | |
| KCl | Sigma | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | Sigma | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| Ethanol | |||
| Autoclaved distilled H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| 50 ml Conical Tube | USA Scentific | 1500-1811 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100×15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
References
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R., Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
- Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
- Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
- Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
- Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
- Bloom, L. . Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
- Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
- Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
- Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
- Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
- Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
- Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
- Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
- Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135 (2007).
- Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42 (2005).
- Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020 (2012).
- Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
- Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
- Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
- Miller, D. M., Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
- Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
- Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. 유전학. 141, 977-988 (1995).
- Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
- Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
- Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
- Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
- Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
- Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
- Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
- Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
- Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
- Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
- Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
- Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505 (2011).
