Secção do nervo tibial - um modelo padronizado para denervação induzida por atrofia muscular em ratos

Summary

O modelo de corte transversal do nervo tibial é um modelo bem-tolerado, validado, e reprodutível de atrofia do músculo esquelético. O protocolo cirúrgico modelo é descrito e demonstrado em ratinhos C57Black6.

Abstract

O modelo de corte transversal do nervo tibial é um modelo bem-tolerado, validado, e reprodutível de atrofia do músculo esquelético desnervação induzida em roedores. Embora originalmente desenvolvido e amplamente utilizado no rato, devido ao seu grande tamanho, o nervo tibial em ratinhos é grande o suficiente para que ele possa ser facilmente manipulada com qualquer esmagamento ou corte transversal, deixando os ramos do nervo sural e fibular do nervo ciático intacta e preservando assim seus músculos alvo. Assim, este modelo oferece as vantagens de induzir menor morbidade e impedimento de locomoção do que o modelo de secção do nervo ciático e também permite aos investigadores estudar os mecanismos biológicos fisiológicos, celulares e moleculares que regulam o processo de atrofia muscular em camundongos geneticamente modificados. O nervo tibial fornece os gastrocnêmio, sóleo e plantar, por isso seu corte transversal permite o estudo do músculo esquelético desnervado composto de fibras de contração rápida do tipo II e / ou tipo de contração lenta Ifibras. Aqui demonstramos o modelo de secção do nervo tibial no C57Black6 mouse. Avaliamos a atrofia do músculo gastrocnêmio, como um músculo representante, em 1, 2 e 4 semanas de pós-denervação medindo pesos musculares e tipo de fibra área transversal específica em parafina cortes histológicos histoquímica para miosina de contração rápida.

Introduction

Desnervação do músculo esquelético, devido a uma lesão traumática do nervo periférico, doença ou intervenção farmacológica, resulta na perda imediata da função contrátil do músculo voluntário. Muscle concomitantemente começa a atrofiar e esta atrofia é reversível se oportuna, reinervação de boa qualidade ocorre ^1,2. Na ausência de Reinervação, myofiber atrofia progride, e alterações biológicas irreversíveis no músculo ocorrer com fibrose muscular e da morte de células musculares. Aqui demonstramos o modelo transecção do nervo tibial, um modelo de atrofia induzida por desinervação do músculo esquelético e da fibrose, em ratinhos. Este modelo permite aos cientistas estudar os mecanismos biológicos fisiológicos, celulares e moleculares subjacentes atrofia muscular in vivo nos músculos gastrocnêmio e sóleo. Enquanto historicamente utilizados predominantemente em ratos, uma aplicação mais recente deste modelo KO e linhas de ratinhos transgénicos especificamente, permite aos investigadores para avaliar o papel da suaproteína específica (s) de interesse na indução, desenvolvimento e manutenção, ou em alternativa, a resolução de, atrofia muscular e fibrose in vivo.

O nervo tibial é um nervo periférico sensório-motora mista no membro posterior do roedor, e é um dos três ramos terminais do nervo ciático. Transecção do nervo tibial denervates o gastrocnêmio, sóleo e plantar (e os três músculos flexores profundos pequenos do pé incluindo tibial posterior, flexor longo dos dedos e flexor hallicus longus), e é um modelo bem padronizados e validados em ratos ^3,4 . Os músculos gastrocnêmio e sóleo pode ser facilmente dissecados em momentos de série postar secção do nervo tibial, fixados e processados ​​para avaliação da histologia muscular e morfometria das fibras musculares, ou flash congelado para a extração de RNA e proteínas musculares para a finalidade de estudar, por exemplo, as redes de sinalização celular que regulam a atrofia muscular. O gastrocnemius muscular é um tipo de fibra muscular mista (tipo I e tipo II, embora seja predominantemente do tipo II) e do músculo sóleo é composta por uma grande proporção de fibras do tipo I, proporcionando deste modo tanto rápido e lento contração muscular para avaliação ^5,6. O modelo de corte transversal do nervo tibial é adequado para o estudo do processo de atrofia induzida por desnervação muscular quer a curto prazo (dias) ⁷ e de longo prazo (semanas a meses) ^4,8.

Em contraste com o modelo de corte transversal do nervo ciático (um segundo modelo de atrofia induzida por desinervação do músculo utilizada em roedores), transecção do nervo tibial induz menor morbidade no animal, tornando-a um modelo mais atraente. A transecção do nervo ciático denervates todos os músculos da perna (abaixo do joelho) e no pé, prejudicar a capacidade do animal para deambulação ^2, enquanto que a transecção do nervo tibial folhas dos ramos do nervo sural e fibular do nervo ciático intacta, preservando assimseus músculos alvo e territórios sensoriais. O mouse é incapaz de flexão plantar ou inverter a pé, mas é capaz de deambular facilmente eo peso tem igualmente em ambos os membros posteriores, assim diminuindo significativamente a morbidade do modelo. Estudos de análise de marcha avaliando padrões de caminhada foram realizados em ratos após lesão do nervo ciático e tibial e demonstrar que a pegada eo peso do rolamento é melhor preservada com lesão tibial ^9,10. Além disso, no modelo de corte transversal do nervo tibial, o nervo peroneal pode ser mobilizada num ponto de tempo posterior e transferido como uma fonte de Reinervação retardada, se o desenho do estudo requer ^3. Em contraste, Reinervação retardada no modelo de corte transversal do nervo ciático que requer a utilização de um enxerto de nervo ao défice do nervo ciático, o aumento muito significativamente a dificuldade técnica do modelo e limitando a sua utilização para os cirurgiões especializados.

Enquanto o modelo de secção do nervo tibial requires familiaridade do operador com técnica cirúrgica estéril em cirurgia animal, tanto o nervo tibial e que inerva os músculos da panturrilha são facilmente acessíveis e identificáveis ​​para a manipulação, de modo que os indivíduos que não são cirurgiões, ou altamente experiente com a cirurgia animal, podem facilmente dominar este modelo .

Protocol

Antes de usar este modelo, os investigadores devem ter recebido aprovação para o protocolo cirúrgico de uso de animais de sua instituição de órgão. O modelo é aprovado pelo Conselho de Ética de Pesquisa, Hamilton Health Sciences Corporation, da Universidade McMaster (AUP # 10-04-24) e é realizado em estrita conformidade com as recomendações do Canadian Council on Animal Care. 1. Rato Preparação Pesar o mouse. Induzir a anestesia com isoflurano 5% ou 2% de halotano. O…

Representative Results

Secção do nervo tibial denervates o gastrocnêmio, sóleo e plantar do bezerro. Aqui nós avaliar o desenvolvimento de atrofia do músculo gastrocnémio, como um representante do músculo. Músculo do gastrocnémio foi colhido 2-3 meses de idade C57Black seis ratinhos (Jackson Laboratories) desnervados por 1, 2 ou 4 semanas. Pesos do músculo diminuir progressivamente (Figura 1), assim como a área de secção transversal de fibras do tipo II rápidas contração muscular (Figura 2),</st…

Discussion

O modelo de corte transversal do nervo tibial induzida por desnervação atrofia do músculo esquelético é um modelo vulgarmente utilizados e bem validado em ratos. Temos este modelo adaptado para utilização em ratinhos, o que permite ao investigador para tirar vantagem da existência de ratos geneticamente modificados e estudar o processo de atrofia muscular in vivo na ausência de proteínas essenciais para a regulação da massa muscular ^7,8. Os músculos gastrocnemius e sóleo, ambos desnerva…

Materials

			Reagents and Materials
10-0 Nylon suture	Ethicon	2850G
5-0 Vicryl suture	Ethicon	J553G
			Equipment
Spring microdissecting scissors	Fine Surgical Tools	15021-15
Ultra fine forceps	Fine Surgical Tools	11370-40
Non locking micro needle holder (driver)	Fine Surgical Tools	12076-12
Spring retractor	Fine Surgical Tools	17000-02