Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

Summary

Rettung von rekombinanten Arenaviren von geklonten cDNAs, ein Ansatz, so genannte Reverse Genetik, ermöglicht es den Forschern, die Rolle der spezifischen viralen Genprodukte, sowie den Beitrag ihrer unterschiedlichen spezifischen Domänen und Rückstände zu untersuchen, um viele verschiedene Aspekte der Biologie von Arenavirus . Ebenso Techniken reverser Genetik in FDA-zugelassenen Zelllinien (Vero) für die Impfstoffentwicklung bietet neue Möglichkeiten für die Erzeugung und sichere Impfstoffe zur Bekämpfung von humanpathogenen Arenaviren.

Abstract

Die Entwicklung und Umsetzung von Arenavirus reversen Genetik stellt einen bedeutenden Durchbruch in der Arenavirus Feld ^4. Die Verwendung von zellbasierten Arenavirus Minigenom Systeme zusammen mit der Fähigkeit, rekombinante infektiöse Arenaviren mit vorgegebenen Mutationen in ihrem Genom erzeugen hat die Untersuchung der Beteiligung von viralen Faktoren zu den verschiedenen Stufen des Lebenszyklus Arenavirus sowie Virus-Wirt erleichtert Wechselwirkungen und Mechanismen der Pathogenese Arenavirus ^{1, 3, 11.} Darüber hinaus hat die Entwicklung von trisegmented Arenaviren die Verwendung der Arenavirus Genom zusätzliche fremde Gene von Interesse exprimieren gestattet und eröffnet damit die Möglichkeit, Arenavirus basierender Impfstoff Vektor Anwendungen ^5. Ebenso bietet die Entwicklung von Single-Cycle-infektiösen Arenaviren auszudrücken vermag Reportergene ein neues experimentelles Werkzeug, um die Sicherheit der Forschung mit highl verbesserny pathogenen menschlichen Arenaviren ^16. Die Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken bislang auf die Verwendung von Nagetier-Zelllinien ^7,19, die einige Hindernisse für die Entwicklung der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Impfstoff-oder Vakzinvektoren Posen verlassen. Um dieses Hindernis zu überwinden, beschreiben wir hier die effiziente Erzeugung von rekombinanten Arenaviren in FDA-zugelassenen Vero-Zellen.

Introduction

Arenaviren sind umhüllte Viren mit einem bisegmented negative RNA-Genom, dass ³ der Arenaviridae Familie gehören. Die Arenavirus Genom kodiert vier Proteine ​​in einer AmbiSense Mode aus zwei getrennten viralen Segmente ^3. Der große (L)-Segment kodiert für das RNA-abhängigen RNA-Polymerase (L) und die kleine RING (Really Interesting New Gene) finger protein (Z), die als die wichtigste treibende Kraft der Virusknospung dient. Die kleinen (S)-Segment kodiert für das virale nucleoprotein (NP) und die Oberflächen-Glykoprotein (GP) (Abbildung 1).

Mehrere Mitglieder der Familie Arenaviridae sind verantwortlich für die tödlichen hämorrhagischen Fieber (HF) in Menschen ^3. Grundsätzlich Bedenken sind Lassa-Virus (LASV) und Junín Virus (JUNV), die bekanntlich hohe Mortalität bei hospitalisierten Patienten ^{8, 9} verursachen. Obwohl diese Viren sind endemisch in Westafrika und ländlichen Argentinien, bzw.mehren sich die Bedenken der Einfuhr von LASV und JUNV zu nicht-endemischen Gebieten aufgrund der erhöhten Reise ^10. Dazu kommt, obwohl in der Regel nicht mit einer schweren Krankheit in den Menschen verbunden sind, wird die prototypische Arenavirus lymphatischer Choriomeningitisvirus (LCMV) einen vernachlässigten Erreger gilt als es Fälle von tödlichen Infektionen bei immungeschwächten Patienten ^{6, 15} und ist verantwortlich für angeborene Missbildungen und Fehlgeburten bei schwangeren Frauen ^{2, 13.} Derzeit gibt es keine FDA-zugelassenen Impfstoffe gegen Arenaviren und Behandlung der Nukleosid-Analogon Ribavirin, die nur teilweise wirksam ist und oft mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden ist, begrenzt.

Die Einführung von Plasmid-basierte reverse genetics ⁴ und Erzeugung rekombinanter Arenaviren ^{7, 19} haben stark auf dem Gebiet der Forschung Arenavirus fortgeschritten. Derzeit werden Nagerzellen (wie BHK-21) für die Gener verwendetation von rekombinanten Arenaviren aufgrund der artspezifischen murine RNA-Polymerase I (pol-I) Promotor, der die anfängliche Transkription der S-und L-Segmente. Allerdings Virus Rettung in BHK-21-Zellen sind keine anerkannte Methode zur Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine Saatgut Kandidaten. Hier dokumentieren wir die Verwendung des menschlichen pol-I-Promotor für eine effiziente Rettung des prototypischen Alten Welt (OW) LCMV und der Neuen Welt (NW) JUNV Candid # 1-Stamm in Vero-Zellen. Mit einer ähnlichen Methode erzielten wir rekombinantes trisegmented LCMV (r3LCMV) und Candid # 1 (r3Candid # 1) Arenaviren, die zwei zusätzliche fremde Gene in zwei verschiedene S RNA Segmente ⁵ codiert enthalten. Dieses neue System nicht nur folgt eine hohe Reproduzierbarkeit und einfache Protokoll, sondern sofort in der Erzeugung von rekombinanten Arenaviren als potentielle Vakzine oder Impfvektor Samen eingeführt werden.

Protocol

1. Arenavirus Rettung Transfektion Unsere Rettungssystem auf der Verwendung beider Polymerase II-Protein-Expressionsplasmide Codieren des Nucleoprotein (NP) und RNA-abhängige RNA-Polymerase-(L), die viralen trans-wirkende Faktoren für die RNA-Replikation und Genexpression des Arenavirus Genoms erforderlich basierend 7, 19, und in der Lage, Plasmide intrazellulären Synthese über die zelluläre RNA-Polymerase I (Pol-I), der S-und L-Antigenom RNA-Spezies 7 leiten. In uns…

Representative Results

Erfolgreiche Rettung eines rekombinanten Wildtyp Arenavirus wird durch das Vorhandensein von viralen Antigenen mit IFA (Fig. 5) bestätigt werden. Im Falle von rekombinanten Viren trisegmented können erfolgreiche virale Rettung durch Beobachtung GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie (6A) beurteilt werden. Erfolgreiche Rettung wird weiter durch die Beurteilung Gluc Ausdruck (6B) bestätigt werden. Repräsentative Ergebnisse, welche die erfolgreiche Rettung von W…

Discussion

Erzeugung von rekombinanten Arenaviren Verwendung von Plasmid-basierte reverse Genetik Techniken hat sich zu einem weit verbreiteten Ansatz zur Untersuchung der vielen verschiedenen Facetten der Arenavirus Biologie. Hier dokumentieren wir eine entscheidende Verbesserung des derzeitigen Systems durch Ausführen Arenavirus rettet in Vero-Zellen, so dass für das Potenzial Generation von FDA-zugelassenen Impfstoff-Kandidaten gegen Arenaviren und Vakzinvektoren gegen andere Infektionskrankheiten.

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Materials

			Material and methods
			Cell lines Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). Plasmids All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer’s recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. Viruses The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. Tissue culture media and solutions DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells. Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections. 10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.