Anticorps coloration dans<em> C. Elegans</em> Utilisation de «gel-Cracking"

Summary

"Freeze-fissuration," une méthode pour exposer les tissus internes du nématode C. elegans aux anticorps pour la localisation des protéines, est démontrée.

Abstract

Pour colorer C. elegans avec des anticorps, la cuticule relativement imperméable doivent être contournés par des méthodes chimiques ou mécaniques. "Freeze-craquage" est une méthode utilisée pour tirer physiquement la cuticule de nématodes en comprimant les nématodes entre deux lames adhérentes, les congeler, et en tirant les diapositives en dehors. Cryo-craquage fournit un moyen simple et rapide pour accéder à des tissus, sans traitement chimique et peut être utilisé avec une variété de fixateurs. Toutefois, elle conduit à la perte d'un grand nombre de spécimens et la compression requise déforme mécaniquement l'échantillon. La pratique est nécessaire pour maximiser la récupération d'échantillons avec une bonne morphologie. Cryo-craquage peut être optimisée pour les conditions spécifiques de fixation, la récupération d'échantillons, ou faible coloration non-spécifique, mais pas pour tous les paramètres à la fois. Pour les anticorps qui requièrent des conditions de fixation très durs et tolèrent les traitements chimiques nécessaires pour perméabiliser chimiquement la cuticule, traitement de nématodes intactes en solution peut être préférée. Si l'anticorps nécessite une solution claire ou plus si les conditions optimales de fixation ne sont pas connus, de gel-craquage est un moyen très utile pour doser rapidement l'anticorps et peuvent donner des informations spécifiques de localisation subcellulaire et cellulaire de l'antigène d'intérêt.

Introduction

Pour déterminer la localisation cellulaire et subcellulaire des protéines, les scientifiques ont toujours marqué les tissus avec des anticorps sélectionnés de reconnaître spécifiquement des protéines particulières ^1. Dans certains organismes modèles tels que C. elegans, la coloration des anticorps a souvent été remplacé par des techniques génétiques moléculaires, qui donnent des résultats plus rapidement. Ceux-ci comprennent les organismes transformants avec des constructions, comprenant des fusions de gène entre le promoteur et les régions codantes du gène d'intérêt et la protéine fluorescente verte. Cependant, les techniques moléculaires sont soumis à un certain nombre d'objets, y compris les problèmes de connaître le véritable promoteur et changements dans l'expression des constructions à grand nombre de copies (les techniques habituelles chez C. elegans) ^2,3. Par conséquent, la coloration avec des anticorps demeure un objectif pour de nombreux scientifiques étudient la fonction des protéines in vivo.

La coloration des tissus avec des anticorps peut être difficile, car untibodies ne peuvent reconnaître leur antigène dans une conformation particulière ^1. Par exemple, les anticorps peuvent reconnaître que l'antigène dénaturé ou intact fixe d'une manière particulière et peuvent ne pas reconnaître l'antigène in situ. Le problème de la coloration des anticorps chez les nématodes est exacerbé par le fait que la cuticule du nématode forme une barrière relativement imperméable, le blocage de l'accès des anticorps aux tissus.

Il existe plusieurs méthodes différentes utilisées pour la coloration des anticorps à C. elegans (revue dans nos travaux précédents ^4). Pour colorer intactes »vers,« méthodes ont été développées pour geler et dégeler dans un fixateur relativement dur (formaldéhyde ou glutaraldéhyde), les cycles de gel-dégel contribuent à fissurer la cuticule pour permettre la pénétration rapide du fixateur ^5. Après fixation, la cuticule a été perméabilisées pour permettre la pénétration de l'anticorps; méthodes comprenaient le traitement avec des agents, la collagénase, ou les deux ^5-7 réduire. Ces Treatments conservés morphologie, mais souvent réduites ou détruites reconnaissance d'anticorps. Méthodes alternatives incluent dissection ⁸ pour permettre la pénétration d'anticorps.

"Freeze-craquage" est un moyen d'accéder à l'intérieur de la semi-ver intact pour permettre anticorps coloration ^9-10. Cryo-craquage peut être effectuée avec une variété de conditions de fixation, tout en évitant des traitements de la collagénase et de réduction. Les nématodes sont placés entre deux lames d'adhésifs, congelés, puis les lames sont séparées, laissant la plupart des nématodes sur la lame de fond et beaucoup de la cuticule sur la lame supérieure. La glissière inférieure peut être placée dans un fixateur et le coulisseau avec l'ensemble de nématodes adhéré est transférée à travers la procédure de coloration à l'anticorps. La méthode ne présentent deux difficultés majeures. Premièrement, il est difficile d'appliquer la bonne quantité de pression nécessaire pour séparer les nématodes sans les déformer sérieusement. Deuxièmement, bon nombre des vers ne sera pas scocher soit diapositive, et sera perdu dans le fixateur ou rinçages. Cependant, avec les diapositives et les pratiques appropriées, la méthode donnera rapidement nématodes morphologie raisonnable qui peut être utilisé avec une grande variété de fixateurs et des anticorps.

Le procédé peut faire varier légèrement, en fonction de l'objectif de l'expérimentateur. Si la coloration des nématodes est désirée (par exemple, pour déterminer si un seul transformant a modifié la coloration des anticorps), puis glisse avec une adhérence maximale (mais supérieur coloration de fond) peut être utilisé, par exemple sous forme de diapositives préparés en laboratoire avec polylysine supplémentaire (voir ci-dessous). Pour le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde fixation, les lames d'adhésion plus élevés (diapositives polylysine préparés en laboratoire) doivent être utilisés, car les nématodes adhèrent plus mal à la polylysine après ces fixations. Si les nématodes de type sauvage sont fixées avec du méthanol et / ou de l'acétone, puis glisse avec une adhérence plus en plus bas bruit de fond doit être utilisé (commercial ou ldiapositives aboratory préparé). Si une variété d'anticorps et fixateurs sont utilisés dans le laboratoire, une sélection de diapositives peut être préparé à l'avance et stocké jusqu'à son utilisation.

Après avoir accès au tissu de nématodes a été gagné, les procédures de coloration anticorps suivent des méthodes standard (avec de plus longues incubations caractéristiques des tissus plutôt que des cellules ^1,11).

Protocol

NOTE: Plusieurs étapes du protocole sont présentés avec des options pour l'installation et la préparation en fonction des conditions spécifiques de l'expérience. Pour ces cas, des mesures alternatives sont présentées comme A, B, C, etc Le protocole de mesures alternatives est présenté dans la figure 1. Une. Préparation des lames Polylysine filmés Trois types de lames différentes peuvent être utilisées, selon le compr…

Representative Results

Lorsque les vers sont bien compressés, fissuré, et légèrement fixés, la quasi-totalité ver peut être accessible à la coloration des anticorps (voir la figure 2). La localisation des noyaux, comme indiqué par la coloration DAPI indique quelles parties de la vis sans fin sont intacts Lorsque les vers sont soumis à un fixateur plus dur, tel que le formaldehyde, la morphologie de la vis sans fin peut être déformée (comme montré par l'apparition anormalement ondulé de l' muscles dans <…

Discussion

Le protocole de congélation-craquage est l'un de plusieurs procédés pour la coloration des anticorps pour C. elegans. C'est un moyen relativement simple pour colorer les vers, mais ne nécessite réactifs spécifiques et pratique pour des résultats optimaux. Les étapes critiques (décrites dans la figure 1): 1) la préparation des lames (voir les étapes 1 et 2) la compression manuelle des nématodes (voir les étapes 2 et 3) la fixation rapide (voir l'étape 3). Tout d'abo…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable