Antibody colorazione in<em> C. Elegans</em> Uso di "Freeze-Cracking"

Summary

"Freeze-cracking," un metodo per esporre i tessuti interni del nematode C. elegans di anticorpi per la localizzazione delle proteine, è dimostrata.

Abstract

Per macchiare C. elegans con anticorpi, la cuticola relativamente impermeabile devono essere aggirati con metodi chimici o meccanici. "Freeze-cracking" è un metodo utilizzato per estrarre fisicamente la cuticola da nematodi comprimendo nematodi tra due diapositive aderenti, il congelamento, e tirando le diapositive a parte. Freeze-fessurazione fornisce un modo semplice e rapido per ottenere l'accesso ai tessuti senza trattamenti chimici e può essere utilizzato con una varietà di fissativi. Tuttavia, porta alla perdita di molti dei campioni e la compressione richiesta distorce meccanicamente il campione. La pratica è necessaria per massimizzare il recupero di campioni con buona morfologia. Freeze-fessurazione può essere ottimizzato per le condizioni specifiche di fissazione, recupero di campioni, o bassa colorazione non specifica, ma non per tutti i parametri contemporaneamente. Per gli anticorpi che richiedono condizioni di fissazione molto duri e tollerano i trattamenti chimici necessari per permeabilize chimicamente la cuticola, treatment di nematodi intatte in soluzione può essere preferito. Se l'anticorpo richiede una correzione chiara o se le condizioni ottimali di fissaggio sono sconosciute, liofilizzazione di cracking fornisce un modo molto utile per saggiare rapidamente l'anticorpo e può produrre specifiche informazioni di localizzazione subcellulare e cellulare per l'antigene di interesse.

Introduction

Per determinare la localizzazione cellulare e subcellulare di proteine, gli scienziati hanno tradizionalmente etichettati tessuti con anticorpi selezionati per riconoscere specificamente particolari proteine ^​​1. In alcuni organismi modello come C. elegans, colorazione anticorpale è stato spesso sostituito da tecniche genetiche molecolari, che danno risultati più rapidamente. Questi includono organismi trasformante con costrutti costituiti da fusioni geniche tra il promotore e regioni codificanti del gene di interesse e proteina fluorescente verde. Tuttavia, le tecniche molecolari sono soggette a una serie di manufatti, compresi i problemi connessi conoscere il vero promotore e cambiamenti nell'espressione di costrutti ad alto numero di copie (le usuali tecniche di C. elegans) ^2,3. Pertanto, la colorazione con anticorpi rimane un obiettivo per molti scienziati che studiano la funzione delle proteine ​​in vivo.

Colorazione tessuti con anticorpi può essere difficile, in quanto untibodies possono riconoscere solo la loro antigene in una particolare conformazione ^1. Ad esempio, gli anticorpi possono riconoscere solo antigene denaturato o intatta fissato in modo particolare e non possono riconoscere l'antigene in situ. Il problema di colorazione anticorpale nei nematodi è aggravata dal fatto che la cuticola del nematode forma una barriera relativamente impermeabile, bloccando l'accesso di anticorpi ai tessuti.

Ci sono diversi metodi utilizzati per la colorazione degli anticorpi in C. elegans (recensito nel nostro precedente lavoro ^4). Per macchiare intatti 'vermi, «metodi sono stati sviluppati per congelare e scongelare in un fissativo relativamente dura (formaldeide o glutaraldeide), i cicli di gelo-disgelo contribuiscono a rompere la cuticola per consentire una rapida penetrazione del fissativo ^5. Dopo la fissazione, la cuticola stata permeabilizzate per consentire la penetrazione dell'anticorpo; metodi inclusi il trattamento con agenti riducenti, collagenasi, o entrambi ^5-7. Queste treatments conservati morfologia, ma spesso ridotti o distrutti riconoscimento anticorpale. Metodi alternativi includono dissezione ⁸ per consentire la penetrazione anticorpo.

"Freeze-cracking" è un modo per ottenere l'accesso all'interno del verme semi-intatte per consentire colorazione anticorpale ^9-10. Freeze-fessurazione può essere eseguita con una varietà di condizioni di fissaggio evitando trattamenti collagenasi e di riduzione. I nematodi sono posti tra due adesivi diapositive, congelati e quindi i vetrini sono separati, lasciando la maggior parte del nematode sul vetrino fondo e gran parte della cuticola sulla slitta superiore. La slitta inferiore può essere posizionato in fissativo e l'intera diapositiva da nematodi aderito viene trasferita attraverso la procedura di colorazione anticorpale. Il metodo non presentano due grandi difficoltà. In primo luogo, è difficile applicare la giusta quantità di pressione necessaria per dividere i nematodi senza deformarli seriamente. In secondo luogo, molti dei vermi non sarà stick a uno scivolo, e sarà perso nel fissativo o risciacqui. Tuttavia, con le diapositive e prassi corrette, il metodo rapidamente produrre nematodi con ragionevole morfologia che può essere utilizzato con una vasta gamma di fissativi e anticorpi.

Il metodo può essere leggermente variato, a seconda della porta dello sperimentatore. Se si desidera una colorazione di singoli nematodi (ad esempio per determinare se un singolo trasformante ha modificato colorazione anticorpale), poi scivola con adesione massima (ma superiore colorazione di fondo) può essere utilizzato, ad esempio diapositive-laboratorio preparati con polilisina supplementare (vedi sotto). Per formaldeide o fissazione glutaraldeide, diapositive di adesione superiori (slides polilisina-laboratorio preparati) devono essere utilizzati, dal momento che i nematodi aderiscono più male di polilisina dopo queste fissazioni. Se wild-type nematodi sono stati fissati con metanolo e / o acetone, poi scivola con l'adesione sempre più in basso la colorazione di fondo deve essere utilizzato (commerciale oppure lvetrini aboratory preparati). Se una varietà di anticorpi e fissativi sono utilizzati nel laboratorio, una selezione di diapositive può essere preparato in anticipo e conservato fino al momento dell'uso.

Dopo l'accesso al tessuto nematode è stata acquisita, le procedure di anticorpi colorazione seguono metodi standard (con incubazione più caratteristici dei tessuti, piuttosto che le cellule ^1,11).

Protocol

NOTA: Più passaggi di protocollo vengono presentati con opzioni per set-up e la preparazione a seconda delle specifiche condizioni dell'esperimento. Per questi casi, passaggi alternativi vengono presentati come A, B, C, ecc Il protocollo con la procedura alternativa è illustrato in Figura 1. 1. Preparazione di diapositive Polilisina rivestite Tre diversi tipi di diapositive possono essere utilizzati a seconda del compromesso desidera…

Representative Results

Quando i vermi sono adeguatamente compressi, incrinato, e leggermente fissi, praticamente l'intero worm può essere accessibile a colorazione anticorpale (vedi figura 2). La posizione dei nuclei come indicato dalla colorazione DAPI indica quali parti del verme sono intatti Quando i vermi sono sottoposti ad un fissativo più duro, come la formaldeide, la morfologia della vite senza fine può essere distorta (come si vede dalla comparsa innaturale ondulata del muscoli nelle figure 3a-D).</stro…

Discussion

Il protocollo di congelamento di cracking è uno dei diversi metodi per la colorazione degli anticorpi in C. elegans. Esso fornisce un modo relativamente semplice per colorare i vermi, ma richiede reagenti specifici e pratica per ottenere risultati ottimali. Passaggi critici (descritti nella Figura 1) includono: 1) preparazione del vetrino (vedi punti 1 e 2) la compressione manuale dei nematodi (vedere i passi 2 e 3) di fissaggio rapido (vedi punto 3). In primo luogo, per massimizzare l'ade…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable