항체 염색법에<em> C. 엘레</em> "동결 크래킹 사용"
Summary
"동결 균열"선충 C.의 내부 조직을 노출시키는 방법 단백질의 지역화를위한 항체의 elegans는 보여줍니다.
Abstract
C. 얼룩하려면 항체 엘레은 상대적으로 스며 들지 표피는 화학 물질 또는 기계적인 방법으로 우회해야합니다. "동결 균열은"물리적으로 두 개의 부착 슬라이드 사이에 선충을 압축을 동결하고, 떨어져 슬라이드를 당겨 선충에서 표피를 당겨하는 데 사용하는 한 가지 방법입니다. 동결 크래킹 화학적 처리없이 조직에 접근 할 수있는 간단하고 신속한 방법을 제공하고, 고정 제의 종류와 사용될 수있다. 그러나, 시편의 많은 손실로 연결하고 필요한 압축 기계적 샘플을 왜곡. 연습은 좋은 형태로 샘플의 회복을 극대화하기 위해 필요합니다. 동결 균열은 특정 고정 조건, 샘플의 복구, 또는 낮은 비특이적 염색에 최적화 된,하지만 모든 매개 변수에 대해 한 번에 할 수있다. 열심히 고정 조건을 필요로하고 화학적으로 표피를 투과하는 데 필요한 화학적 처리, treatmen를 허용 항체솔루션에 그대로 선충의 t는 바람직 할 수있다. 항체는 점화기 수정을 필요로하거나 최적 정착 조건이 알려지지 않은 경우에, 동결 크래킹 급속 항체을 검정하고 그 항원에 대한 특정 세포 내 및 세포 지역화 정보를 얻을 수있는 매우 유용한 방법을 제공하는 경우.
Introduction
단백질의 세포 및 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 과학자들은 전통적으로 구체적으로 특정 단백질 1을 인식하는 선택 항체와 조직을 표시했다. C와 같은 일부 모델 생물에서 엘레, 항체 염색은 종종 더 빠르게 결과를 얻을 분자 유전 학적 기술에 의해 대체되었습니다. 이들은 발기인 및 관심과 녹색 형광 단백질의 유전자의 코딩 영역 사이의 유전자의 융합으로 이루어진 구조로 변형 생물체 (가) 있습니다. 그러나, 분자 기술은 진정한 프로와 높은 사본 번호 (C. elegans의에서 통상의 기술) 2,3에서 구조의 발현의 변화를 알 수있는 문제를 포함하여 유물의 숫자로 될 수 있습니다. 따라서 항체 염색은 생체 내에서 단백질 기능을 연구 많은 과학자의 골이 남아있다.
항체와 조직을 염색하는 것은 어려울 수 있기 때문에tibodies는 특정 형태 1에서 자신의 항원을 인식 할 수 있습니다. 예를 들어, 항체는 특정 방식으로 고정 만 변성 또는 손상 항원을 인식 할 수 있으며, 현장에서 항원을 인식하지 못할 수 있습니다. 선충의 항체 염색의 문제는 선충의 표피 조직에 대한 항체의 액세스를 차단, 상대적으로 불 침투성 장벽을 형성한다는 사실에 의해 악화된다.
C. 항체 염색에 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다 엘레 (우리의 이전 작업에서 검토 4). 그대로 얼룩이 '웜'방법은 동결 상대적으로 하드 정착 (포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드)에 해동하기 위해 개발되었습니다, 동결 해동 사이클은 정착 5의 빠른 침투를 허용하는 표피를 해독하는 데 도움이됩니다. 방법은 제, 콜라게나 제, 또는 둘 모두를 감소 5-7 치료를 포함; 고정 후, 표피는 항체의 침투를 허용하기 permeabilized 하였다. 이 treatments는 형태를 유지하지만, 종종 항체 인식을 감소 시키거나 파괴. 다른 방법은 항체의 침투를 허용하는 해부 8 있습니다.
"동결 균열은"항체가 9-10 염색 할 수 있도록 반 그대로 웜의 내부에 액세스 할 수있는 한 가지 방법입니다. 콜라게나 제 및 환원 처리를 회피하면서 동결 크래킹 정착 다양한 조건으로 행할 수있다. 선충은 두 접착제 슬라이드 사이에 냉동 한 다음 슬라이드가 분리되어, 하단 슬라이드에 선충의 대부분 상단 슬라이드에 표피의 대부분을 떠나고있다. 바닥 슬라이드 정착액에 배치 될 수 있고 부착 선충과 전체 슬라이드는 항체 염색 절차를 통해 전송된다. 이 방법은 현재 두 가지 어려움을한다. 첫째, 그들을 심각하게 변형없이 선충을 분리하는 데 필요한 압력의 정확한 금액을 적용하기가 어렵습니다. 둘째, 웜의 많은의하지 않습니다하나의 슬라이드에 진드기 및 정착 또는 헹굼에 손실됩니다. 그러나, 적절한 슬라이드 및 연습, 방법은 급속 고정 제와 항체의 다양한 함께 사용할 수있는 적당한 형태로 선충을 수득한다.
방법은 실험의 목표에 따라 다소 변할 수있다. 단일 선충의 염색이 (예를 들어, 하나의 형질 전환 항체 염색을 변경했는지 여부를 확인하기 위해) 필요한 경우, 최대 접착력과 슬라이드 (그러나 높은 배경 염색) (아래 참조)와 같은 별도의 폴리 라이신 실험실 준비된 슬라이드로 사용할 수 있습니다. 선충이 고착 후 폴리 라이신을 더 가난하게 준수하기 때문에 포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드 고정 용, 높은 접착 슬라이드 (실험실에서 제조 된 폴리 라이신 슬라이드), 사용되어야한다. 야생형 선충은 메탄올 및 / 또는 아세톤으로 고정되는 경우, 낮은 밀착성 슬라이드 및 하부 배경 염색 표기 (상업적 또는 L) 슬라이드를 aboratory – 준비. 항체 및 고정 제의 다양한 실험실에서 사용중인 경우, 슬라이드의 선택은 미리 제조 될 수 있고, 필요할 때까지 저장된다.
선충 조직에 대한 액세스가 획득 한 후, 항체 염색 절차는 (더 이상 조직의 특성 배양보다는 세포 1,11으로) 표준 방법을 따릅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
동결 균열 프로토콜 C. 항체 염색을위한 여러 가지 방법 중 하나입니다 엘레. 그것은 벌레를 염색 할 수있는 비교적 간단한 방법을 제공하지만, 특정 시약을 필요로하고 최적의 결과를 위해 연습 않습니다. (그림 1에 나와있는) 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 슬라이드 준비 () 3 단계 참조 (2 단계와 3 단계) 빠른 고정을 참조하십시오 (1 단계와 선충의 2) 수동 압축을 참…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
자금은 NSF CCLI 번호 0,633,618 및 오하이오 대학에 의해 제공되었다. 일부 변종은 Caenorhabditis의 유전학 센터에 의해 제공되었다. 대학원생 Reetobrata 바수는 비디오에 나타납니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
References
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