Antistoffarging i<em> C. Elegans</em> Ved hjelp av "Freeze-Cracking"

Summary

"Fryse-cracking", en fremgangsmåte for å utsette det indre vev av nematode C. elegans til antistoffer for protein lokalisering, er demonstrert.

Abstract

Å farge C. elegans med antistoffer, må den relativt ugjennomtrengelig hårstråene omgås ved kjemiske eller mekaniske metoder. "Freeze-cracking" er en metode som brukes til å fysisk dra hårstråene fra nematoder ved å komprimere nematoder mellom to heft lysbilder, fryse dem, og dra lysbildene fra hverandre. Fryse-cracking er en enkel og rask måte for å få tilgang til vev uten kjemisk behandling, og kan brukes med en rekke fiksativ. Men det fører til tap av mange av prøvene og den nødvendige kompresjon mekanisk forvrenger prøven. Praksis er nødvendig for å maksimere utvinningen av prøver med god morfologi. Fryse-cracking kan optimaliseres for spesifikke fiksering forhold, gjenvinning av prøver, eller lav ikke-spesifikk farging, men ikke for alle parametre samtidig. For antistoffer som krever svært harde festeforhold og tolerere de kjemiske behandlinger for å kjemisk permeabilize skjellaget, treatment av intakte nematoder i løsning kan være å foretrekke. Dersom antistoffet krever en lettere løsning, eller dersom de optimale fiksering betingelser er ukjente, gir fryse-cracking en meget nyttig måte å raskt analysen antistoffet, og kan gi spesifikke subcellulære og cellulær lokalisering informasjon for antigenet av interesse.

Introduction

For å bestemme den cellulære og subcellulære lokalisering av proteiner, har forskere tradisjonelt merket vev med antistoffer valgt å spesifikt gjenkjenne spesielle proteiner ^en. I noen modellorganismer slik som C. elegans, har antistoffarging ofte blitt erstattet av molekylærgenetiske teknikker, som gir resultater raskere. Disse omfatter transformere organismer med konstruksjoner som består av gen-fusjoner mellom promoter og kodende regioner av genet av interesse og grønt fluorescerende protein. Imidlertid molekylære teknikker er gjenstand for en rekke gjenstander, inkludert problemer med å kjenne den virkelige promoter og endringer i ekspresjon av konstruksjoner med høy kopitall (de vanlige teknikkene i C. elegans) ^2,3. Derfor, farging med antistoffer er fortsatt et mål for mange forskere som studerer protein funksjon in vivo.

Beising vev med antistoffer kan være vanskelig, ettersom entibodies kan bare anerkjenne deres antigen i en bestemt konformasjon ^en. For eksempel kan antistoffer gjenkjenne bare denaturert eller intakt antigen fast på en bestemt måte, og kan ikke gjenkjenne antigen in situ. Problemet med antistoffarging i nematoder blir forverret av det faktum at hårstråene av nematode danner en relativt ugjennomtrengelig barriere, blokkerer tilgang av antistoffer til vev.

Det finnes flere ulike metoder som brukes for antistoffarging i C. elegans (anmeldt i vår tidligere arbeid ^4). Å farge intakte 'ormer,' ble metoder utviklet for å fryse og tine i en relativt vanskelig fiksativ (formaldehyd eller glutaraldehyd), fryse-tine sykluser bidra til å knekke hårstråene for å tillate rask penetrering av fiksativ ^fem. Etter fiksering ble hårstråene permeabilized for å tillate gjennomtrengning av antistoffet, inkludert fremgangsmåter behandling med reduksjonsmidler, kollagenase eller begge deler ^5-7. Disse treatments bevart morfologi, men ofte redusert eller ødelagt antistoff anerkjennelse. Alternative metoder omfatter disseksjon ⁸ å tillate antistoff penetrasjon.

"Freeze-cracking" er en måte å få tilgang til det indre av den semi-intakt ormen å tillate antistoffarging ^9-10. Fryse-cracking kan utføres med en rekke festeforhold samtidig unngå kollagenaseklassene og reduksjon behandlinger. De nematoder er plassert mellom to lim lysbilder, frosset, og deretter lysbildene er separert, etterlot det meste av nematode på bunnen lysbilde og mye av skjellaget på toppen lysbilde. Den nedre glide kan plasseres i fiksativ og hele glide med holdes nematoder blir overført gjennom antistoffarging prosedyre. Metoden gjør presentere to store problemer. For det første er det vanskelig å anvende den riktige mengde av trykket er nødvendig for å splitte de nematoder uten alvorlig å deformere dem. For det andre, er mange av ormer vil ikke stick til enten lysbilde, og vil gå tapt i fiksativ eller skyllinger. Imidlertid, med de riktige lysbilder og praksis, metoden vil raskt gi nematoder med rimelig morfologi som kan brukes sammen med et bredt utvalg av fiksativer og antistoffer.

Fremgangsmåten kan varieres noe, avhengig av målet for experimenter. Ved farging av enkelt-nematoder er ønsket (for eksempel for å bestemme om en enkelt transformant har endret antistoff-farging), glir deretter med maksimal adhesjon (men høyere bakgrunnsfarging) kan benyttes, for eksempel laboratorie-fremstilt lysbilder med ekstra polylysin (se nedenfor). For formaldehyd eller glutaraldehyd fiksering, bør høyere vedheft lysbilder (laboratorie forberedt polylysin lysbilder) brukes, siden nematoder holder seg mer dårlig til polylysin etter disse fikseringer. Dersom vill-type nematoder blir fiksert med metanol og / eller aceton, glir da med lavere klebeevne og lavere bakgrunnsfarging skal brukes (kommersielt eller laboratory forberedt lysbilder). Hvis en rekke antistoffer og fiksativ blir brukt i laboratoriet, kan være forberedt på et utvalg av lysbilder på forhånd og lagres inntil nødvendig.

Etter å ha tilgang til nematode vevet har blitt oppnådd, antistoff fargingsprosedyrer følge standard-fremgangsmåter (med lengre inkubasjoner som er karakteristisk for vevet i stedet for cellene ^1,11).

Protocol

MERK: Flere protokoll trinn presenteres med alternativer for oppsett og klargjøring avhengig av de konkrete forholdene i eksperimentet. For disse tilfellene, er alternative fremgangsmåten presentert som A, B, C osv. Den protokoll med alternative fremgangsmåten er skissert i figur 1.. En. Utarbeidelse av polylysin Coated Slides Tre forskjellige typer av lysbilder kan anvendes, avhengig av det ønskede forhold mellom enkel fremstilling, r…

Representative Results

Når ormer er riktig komprimert, sprakk, og lett fast, kan praktisk talt hele ormen være tilgjengelig for antistoffarging (se figur 2). Plasseringen av kjernen som antydet med DAPI farging indikerer hvilke deler av spiralen er intakte Når ormer er utsatt for en hardere fikseringsmiddel, som for eksempel formaldehyd, kan morfologien av ormen bli forvrengt (sett fra unaturlig bølget utseende Musklene i figurene 3A-D). Et annet vanlig problem er ujevn fiksering eller penetrasjon av best…

Discussion

Det fryse cracking protokoll er en av flere metoder for antistoffarging i C. elegans. Den gir en relativt enkel måte å farge ormer, men krever spesifikke reagenser og øve for å oppnå optimale resultater. Kritiske trinn (skissert i figur 1) er: 1) glide preparat (se trinn 1 og 2) manuell kompresjon av nematoder (se trinn 2 og 3) hurtig fiksering (se trinn 3). Først, for å øke adhesjonen av de nematoder til skinnene, er det best å forberede slides med høy molekylvekt (long polymer) poly…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable