Anticorpo de coloração em<em> C. Elegans</em> Usando o "Freeze-Cracking"

Summary

"Freeze-cracking", um método para expor os tecidos internos do nemátodo C. elegans para anticorpos para localização de proteínas, é demonstrada.

Abstract

Para manchar C. elegans com anticorpos, a cutícula relativamente impermeável deve ser contornado por métodos químicos ou mecânicos. "Freeze-cracking" é um método usado para puxar fisicamente a cutícula de nematóides comprimindo nematóides entre duas lâminas de aderentes, congelá-los, e puxando os slides separados. Congela-craqueamento proporciona uma maneira simples e rápida para obter acesso aos tecidos sem tratamento químico e pode ser utilizado com uma variedade de fixadores. No entanto, isso conduz a uma perda de muitas das amostras e a compressão necessária distorce mecanicamente a amostra. Prática é necessária para maximizar a recuperação de amostras com boa morfologia. Congela-craqueamento pode ser optimizado para as condições específicas de fixação, a recuperação de amostras, ou a coloração não específica baixos, mas não para todos os parâmetros de uma vez. Para anticorpos que requerem condições de fixação muito rígidos e tolerar os tratamentos químicos necessários para permeabilizar quimicamente a cutícula, tratamentt de nemátodos intactas em solução pode ser preferida. Se o anticorpo requer uma posição mais clara ou se as condições de fixação ideais são desconhecidas, congelar-cracking fornece uma maneira muito útil para analisar rapidamente o anticorpo e pode render informações específicas localização subcelular e celular para o antígeno de interesse.

Introduction

Para determinar a localização celular e subcelular de proteínas, os cientistas têm tradicionalmente marcado tecidos com anticorpos seleccionadas para reconhecer especificamente ^um especial proteínas. Em alguns organismos modelo, como C. elegans, coloração do anticorpo foi frequentemente substituído por técnicas de genética molecular, que produzem resultados mais rapidamente. Estes incluem a transformação de organismos com construções que consistem de fusões de genes entre as regiões de codificação do gene de interesse e proteína fluorescente verde e promotor. No entanto, as técnicas moleculares estão sujeitas a um número de artefactos, incluindo problemas com a saber o verdadeiro promotor e alterações na expressão de construções no número de cópias alto (as técnicas usuais em C. elegans) ^2,3. Portanto, a coloração com anticorpos continua a ser uma meta para muitos cientistas que estudam a função da proteína in vivo.

A coloração de tecidos com anticorpos pode ser difícil, uma vez que umtibodies só pode reconhecer o seu antígeno em uma determinada conformação ^1. Por exemplo, os anticorpos podem reconhecer apenas antígeno desnaturado ou intacto fixo de uma maneira particular e pode não reconhecer o antígeno in situ. O problema de coloração do anticorpo em nemátodos é exacerbado pelo facto de a cutícula do nemátodo forma uma barreira relativamente impermeável, impedindo o acesso dos anticorpos aos tecidos.

Existem vários métodos diferentes usados ​​para a coloração do anticorpo em C. elegans (revisado em nosso trabalho anterior ^4). Para manchar intactas 'vermes', métodos foram desenvolvidos para congelar e descongelar em um fixador relativamente duro (formaldeído ou glutaraldeído), os ciclos de congelamento e descongelamento ajudar a quebrar a cutícula para permitir a rápida penetração do fixador ^5. Após a fixação, a cutícula foi permeabilizadas para permitir a penetração do anticorpo; métodos incluído o tratamento com agentes, colagenase, ou ambos ^5-7 redução. Estes treatments preservada morfologia, mas o reconhecimento de anticorpos frequentemente reduzido ou destruído. Os métodos alternativos incluem a dissecção ⁸ para permitir a penetração do anticorpo.

"Freeze-cracking" é um meio de ganhar acesso ao interior do semi-sem-fim para permitir que o anticorpo intacto de coloração ^9-10. Congela-craqueamento pode ser realizada com uma variedade de condições de fixação, evitando tratamentos de colagenase e de redução. Os nemátodos são colocados entre duas lâminas de adesivos, congelado, e, em seguida, as lâminas são separadas, deixando a maior parte do nemátodo na lâmina inferior e a maior parte da cutícula na corrediça superior. A corrediça inferior pode ser colocado em fixador e toda a lâmina com nemátodos aderidas é transferida através do procedimento de coloração do anticorpo. O método não apresenta duas grandes dificuldades. Primeiro, é difícil de aplicar a quantidade correcta de pressão necessária para dividir os nematóides, sem comprometer seriamente deformando-as. Em segundo lugar, muitos dos vermes não vai sassinale a qualquer slide, e serão perdidas no fixador ou lavagens. No entanto, com as lâminas e práticas adequadas, o método irá produzir rapidamente os nemátodos com morfologia razoável que pode ser usado com uma grande variedade de fixadores e anticorpos.

O método pode ser ligeiramente variada, dependendo do objetivo do experimentador. Se a coloração de nemátodos individuais se desejado (por exemplo, para determinar se um único transformante alterou coloração do anticorpo) e, em seguida desliza com adesão máxima (mas maior fundo de coloração) pode ser utilizado, tais como lâminas, obtidos em laboratório com polilisina adicional (ver abaixo). Para formaldeído ou glutaraldeído fixação, lâminas de adesão mais elevados (slides de polilisina preparado em laboratório) devem ser utilizados, uma vez que nematóides aderir mais mal ao polilisina depois dessas fixações. Se tipo selvagem nemátodos estão fixadas com metanol e / ou de acetona, em seguida desliza para baixo com a adesão e menor coloração de fundo deve ser utilizada (comercial ou llâminas aboratory preparado). Se uma variedade de anticorpos e fixadores estão a ser utilizados em laboratório, uma variedade de lâminas podem ser preparadas com antecedência e guardadas até serem necessários.

Após o acesso ao tecido nematóide foi adquirida, procedimentos de coloração de anticorpos seguir métodos padrão (com incubações mais característicos de tecidos em vez de células ^1,11).

Protocol

NOTA: Várias etapas do protocolo são apresentados com opções para set-up e preparação, dependendo das condições específicas de cada ensaio. Para estes casos, as etapas alternativas são apresentados como A, B, C, etc O protocolo com passos alternativos é descrito na Figura 1. 1. Preparação de Slides Polilisina revestidos Podem ser utilizados três tipos diferentes de lâminas, dependendo da troca desejada entre a facilidade de …

Representative Results

Quando worms são devidamente compactado, rachado, e levemente fixo, praticamente todo o worm pode ser acessível a coloração de anticorpos (ver Figura 2). A localização dos núcleos, tal como indicado por coloração com DAPI indica quais as partes do sem-fim está intacto Quando os vermes são submetidos a um fixador mais difícil, tal como o formaldeído, a morfologia do verme pode ficar distorcida (como pode ser visto pela aparência não natural ondulada do músculos nas Figuras 3A-D).<…

Discussion

O protocolo de congelamento de craqueamento é um dos vários métodos para a coloração do anticorpo em C. elegans. Ele fornece uma maneira relativamente simples de manchar vermes, mas exige reagentes específicos e prática para os melhores resultados. As etapas críticas (esboçado na Figura 1) incluem: 1) preparação de slides (consulte as etapas 1 e 2) de compressão manual dos nematóides (veja as etapas 2 e 3) de fixação rápida (ver passo 3). Em primeiro lugar, para maximizar a ades…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable