Tinción de anticuerpos en<em> C. Elegans</em> Uso de "Freeze-Cracking"

Summary

"Freeze-craqueo," un método para exponer los tejidos internos del nematodo C. elegans a anticuerpos para la localización de proteínas, se demuestra.

Abstract

Para la tinción de C. elegans con anticuerpos, la cutícula relativamente impermeable deben ser anuladas por métodos químicos o mecánicos. "Freeze-cracking" es un método utilizado para extraer físicamente la cutícula de los nematodos mediante la compresión de nematodos entre dos diapositivas adherentes, la congelación, y tirando de las diapositivas aparte. Freeze-craqueo proporciona una manera simple y rápida para obtener acceso a los tejidos sin tratamiento químico y se puede utilizar con una variedad de fijadores. Sin embargo, conduce a la pérdida de muchas de las muestras y la compresión requerida distorsiona mecánicamente la muestra. Se requiere práctica para maximizar la recuperación de muestras con buena morfología. Freeze-craqueo puede ser optimizado para condiciones específicas de fijación, de recuperación de muestras, o bajo la tinción no específica, pero no para todos los parámetros a la vez. Para los anticuerpos que requieren fijación de condiciones muy duras y toleran los tratamientos químicos necesarios para permeabilizar químicamente la cutícula, treatmenpuede ser preferido t de nematodos intactas en solución. Si el anticuerpo requiere una solución más ligero o si las condiciones óptimas de fijación son desconocidos, congelar-craqueo proporciona una manera muy útil para ensayar rápidamente el anticuerpo y puede proporcionar información específica de localización subcelular y celular para el antígeno de interés.

Introduction

Para determinar la localización celular y subcelular de las proteínas, los científicos han denominado tradicionalmente tejidos con anticuerpos seleccionados para reconocer específicamente las proteínas particulares ^1. En algunos organismos modelo como C. elegans, tinción de anticuerpos a menudo ha sido sustituido por técnicas genéticas moleculares, que dan resultados más rápidamente. Estos incluyen los organismos de transformación con constructos que consisten en fusiones de genes entre el promotor y las regiones codificantes del gen de interés y la proteína fluorescente verde. Sin embargo, las técnicas moleculares están sujetas a una serie de artefactos, incluyendo problemas con conocer la verdadera promotor y cambios en la expresión de los constructos en el número de copias alto (las técnicas habituales en C. elegans) ^2,3. Por lo tanto, la tinción con anticuerpos sigue siendo un objetivo para muchos científicos que estudian la función de proteínas in vivo.

La tinción con anticuerpos tejidos puede ser difícil, ya que untibodies sólo podrán reconocer su antígeno en una determinada conformación ^1. Por ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer sólo antígeno desnaturalizado o intactos fija de una manera particular y pueden no reconocer el antígeno in situ. El problema de la tinción de anticuerpos en los nematodos se ve agravada por el hecho de que la cutícula del nematodo forma una barrera relativamente impermeable, bloqueando el acceso de los anticuerpos a los tejidos.

Hay varios métodos diferentes utilizados para la tinción de anticuerpos en C. elegans (revisado en nuestros trabajos anteriores ^4). Para la tinción intactas "gusanos, 'se desarrollaron métodos para congelar y descongelar en un fijador relativamente duro (formaldehído o glutaraldehído), los ciclos de congelación-descongelación ayudan a romper la cutícula para permitir una rápida penetración del fijador ^5. Después de la fijación, la cutícula se permeabilizaron para permitir la penetración del anticuerpo; métodos incluyen el tratamiento con agentes, colagenasa, o tanto la reducción de ^5-7. Estos treatments conservan la morfología, pero a menudo reducen o destruyen el reconocimiento de anticuerpos. Los métodos alternativos incluyen la disección ⁸ para permitir la penetración de anticuerpos.

"Freeze-cracking" es una forma de obtener acceso al interior del gusano semi-intacta para permitir la tinción de anticuerpos ^9-10. Freeze-craqueo se puede realizar con una variedad de condiciones de fijación, evitando tratamientos de colagenasa y de reducción. Los nematodos se colocan entre dos adhesivos diapositivas, congeladas, y luego las diapositivas se separan, dejando la mayor parte del nematodo en el portaobjetos inferior y gran parte de la cutícula en la diapositiva superior. La corredera inferior se puede colocar en fijador y toda la diapositiva con nematodos adheridas se transfiere a través del procedimiento de tinción de anticuerpos. El método no presentan dos dificultades principales. En primer lugar, es difícil aplicar la cantidad correcta de presión necesaria para dividir los nematodos sin deformar gravemente ellos. En segundo lugar, muchos de los gusanos no se smarque a cualquiera de diapositivas, y se perderá en el fijador o enjuagues. Sin embargo, con los portaobjetos y la práctica adecuados, el método producirá rápidamente nematodos con morfología razonable que se puede utilizar con una amplia variedad de fijadores y anticuerpos.

El método se puede variar ligeramente, dependiendo de la meta del experimentador. Si se desea tinción de los nematodos individuales (por ejemplo, para determinar si un único transformante ha alterado la tinción de anticuerpos), a continuación, se desliza con la adhesión máxima (pero mayor tinción de fondo) se puede utilizar, tales como diapositivas preparadas en el laboratorio con polilisina adicional (ver más abajo). Para formaldehído o glutaraldehído fijación, toboganes más altos de adhesión (diapositivas polylysine preparadas en el laboratorio) deben ser usados, ya que los nematodos se adhieren más mal a la polilisina después de estas fijaciones. Si los nematodos de tipo salvaje se fijaron con metanol y / o acetona, y luego se desliza con una menor adherencia y la tinción de fondo más baja se debe utilizar (comercial o de ldiapositivas aboratory preparados). Si una variedad de anticuerpos y fijadores están siendo utilizados en el laboratorio, una selección de diapositivas se puede preparar con anticipación y se almacena hasta que se necesita.

Después de acceso al tejido nematodo se ha adquirido, los procedimientos de tinción de anticuerpos siguen métodos estándar (con incubaciones más largas característicos de los tejidos en lugar de células de ^1,11).

Protocol

NOTA: los pasos de protocolo múltiple se presentan con opciones para la puesta a punto y preparación en función de las condiciones específicas del experimento. Para estos casos, pasos alternativos se presentan como A, B, C, etc El protocolo con pasos alternativos se describe en la Figura 1. 1. Preparación del portaobjetos recubiertos Polilisina Se dispone de tres tipos diferentes de diapositivas, dependiendo del equilibrio deseado ent…

Representative Results

Cuando los gusanos se comprimen correctamente, agrietados, y ligeramente fijos, prácticamente todo el gusano puede ser accesible para la tinción de anticuerpos (ver Figura 2). La ubicación de los núcleos, como se indica por la tinción DAPI indica qué partes del gusano están intactos Cuando los gusanos se someten a un fijador más duro, tal como formaldehído, la morfología del gusano puede distorsionarse (como se ve por la aparición no natural ondulado de la músculos de las figuras 3A-…

Discussion

El protocolo de congelación de craqueo es uno de varios métodos para la tinción de anticuerpos en C. elegans. Proporciona una manera relativamente fácil de manchar los gusanos, pero requiere de reactivos específicos y práctica para obtener resultados óptimos. Los pasos críticos (descritos en la Figura 1) son: 1) la preparación de diapositivas (consulte los pasos 1 y 2) la compresión manual de los nematodos (consulte los pasos 2 y 3) de fijación rápida (ver paso 3). En primer lugar, …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable