Antikropp färgning i<em> C. Elegans</em> Använda "Freeze-Cracking"

Summary

"Freeze-cracking," en metod för att exponera de inre vävnaderna i nematoden C. elegans till antikroppar för proteinlokalisering, demonstreras.

Abstract

Att färga C. elegans med antikroppar, måste den relativt ogenomträngliga nagelband kringgås genom kemiska eller mekaniska metoder. "Freeze-cracking" är en metod som används för att fysiskt dra i nagelbanden från nematoder genom att komprimera nematoder mellan två tillhörande bilder, frysa dem och dra bilderna isär. Fryst krackning ger ett enkelt och snabbt sätt att få tillgång till vävnaderna utan kemisk behandling och kan användas med en mängd olika fixeringsmedel. Däremot leder det till förlust av många av proverna och den nödvändiga kompressionen snedvrider mekaniskt provet. Öva krävs för att maximera återvinningen av prover med god morfologi. Fryst sprickbildning kan optimeras för specifika fixeringsförhållanden, återvinning av prover, eller låg ospecifik färgning, men inte för alla parametrar på en gång. För antikroppar som kräver mycket hårda fixeringsförhållanden och tål de kemiska behandlingar som behövs för att kemiskt permeabilize nagelbanden, treatment av intakta nematoder i lösning kan vara att föredra. Om antikroppen kräver en lättare fix eller om de optimala fixeringsförhållandena är okänd, tillhandahåller frys krackning ett mycket användbart sätt att snabbt analysera antikroppen och kan ge specifika subcellulära och cellulära lokaliseringen informationen för antigenet av intresse.

Introduction

För att bestämma den cellulära och subcellulära lokalisering av proteiner, har forskare traditionellt märkta vävnader med antikroppar som valts för att specifikt känna igen särskilda proteiner ^1. I vissa modellorganismer såsom C. elegans har antikroppsfärgning ofta ersatts av molekylärgenetiska tekniker, vilka ger resultat snabbare. Dessa innefattar transformerande organismer med konstrukt bestående av genfusioner mellan promotor och kodande regioner av genen av intresse och grönt fluorescerande protein. Molekylära tekniker är dock föremål för ett antal artefakter, bland annat problem med att känna den sanna promotorn och förändringar i uttryck av konstruktioner på ett stort antal kopior (de vanliga teknikerna i C. elegans) ^2,3. Därför färgning med antikroppar förblir ett mål för många forskare som studerar proteiners funktion in vivo.

Färgning vävnader med antikroppar som kan vara svårt, eftersom entibodies får bara erkänna deras antigen i en viss konforma ^1. Till exempel kan antikroppar känner igen endast denatureras eller intakt antigen fast på ett visst sätt och kanske inte känner igen antigenet in situ. Problemet med antikroppar färgning i nematoder förvärras av det faktum att nagelbanden av nematoden bildar en relativt ogenomtränglig barriär, blockera åtkomst av antikroppar till vävnaderna.

Det finns flera olika metoder som används för antikroppsfärgning i C. elegans (över i vårt tidigare arbete ^4). Att färga intakta "maskar," har metoder utvecklats för att frysa och tina i ett relativt hårt fixativ (formaldehyd eller glutaraldehyd), de frys-tö cykler hjälpa knäcka nagelbanden för att möjliggöra en snabb penetration av fixativ ^5. Efter fixering till ytterhud permeabiliseras för att medge penetrering av antikroppen; metoder inkluderade behandling med reduktionsmedel, kollagenas, eller både och ^5-7. Dessa treatments bevarade morfologi, men ofta reduceras eller förstörda antikroppsigenkänning. Alternativa metoder inkluderar dissektion ⁸ för att möjliggöra penetration antikropp.

"Freeze-cracking" är ett sätt att få tillgång till det inre av det halv intakt mask för att tillåta antikroppsfärgning ^9-10. Fryst krackningen kan genomföras med en mängd olika fixeringsförhållanden samtidigt som man undviker kollagenas-och reduktionsbehandlingar. Nematoderna är placerade mellan två lim diabilder, frysta och sedan objektglasen separerades, lämnar de flesta av nematoden på botten sliden och mycket av ytterhud på översta objektglaset. Den nedre bild kan placeras i fixativ och hela bilden med vidhäftade nematoder överförs genom antikroppsfärgningsproceduren. Metoden ställer dock två stora problem. För det första är det svårt att tillämpa rätt mängd tryck som krävs för att dela upp de nematoder utan att allvarligt deformera dem. För det andra, många av maskarna kommer inte skryssa antingen glida, och kommer att gå förlorade i fixativ eller sköljningar. Men med de riktiga diabilder och praxis, varvid förfarandet kommer snabbt erhållande nematoder med rimlig morfologi som kan användas med en mängd olika fixativ och antikroppar.

Metoden kan varieras något, beroende på målet för den som utför experimentet. Om färgning av enstaka nematoder önskas (t.ex. för att fastställa om en enda trans har förändrat antikroppsfärgning), glider sedan med maximal vidhäftning (men högre bakgrundsfärgning) kan användas, till exempel laboratorie förberedda bilder med extra polylysin (se nedan). För formaldehyd eller glutaraldehyd fixering bör högre vidhäftnings diabilder (laboratorie förberedda polylysin diabilder) användas, eftersom nematoder hålla sig sämre till polylysin efter dessa upptagningar. Om vildtyp nematoder slås fast med metanol och / eller aceton, glider sedan med lägre friktion och lägre bakgrundsfärgning bör användas (kommersiella eller laboratory förberedda diabilder). Om en mängd olika antikroppar och fixativ som används i laboratoriet, kan ett urval av glas förberedas i förväg och lagras tills det behövs.

Efter tillgång till nematoden vävnad har vunnits, antikroppsfärgningsförfaranden följer standardmetoder (med längre inkubationer karakteristiska av vävnader snarare än celler ^1,11).

Protocol

OBS: Flera protokollsteg presenteras med alternativ för installation och förberedelse beroende på de särskilda villkoren för experimentet. För dessa fall finns alternativa åtgärder presenteras som A, B, C, etc. Protokollet med alternativa åtgärder som skisseras i figur 1. 1. Beredning av Polylysin Coated Slides Tre olika typer av bilder kan användas, beroende på den önskade avvägningen mellan enkel framställning, relativ vid…

Representative Results

När maskarna är ordentligt komprimerade, knäckt, och lätt fast, kan i stort sett hela masken vara tillgänglig för antikroppsfärgning (se figur 2). Placeringen av kärnorna vilket indikeras av DAPI färgning visar vilka delar av masken är intakta När maskarna utsätts för en hårdare fixeringsmedel, såsom formaldehyd, kan morfologi masken blir förvrängd (som ses av onaturligt vågig utseende muskler i figurerna 3A-D). Ett annat vanligt problem är ojämn fixering eller penet…

Discussion

Den fryst sprickbildning protokollet är en av flera metoder för antikroppsfärgning i C. elegans. Det ger ett relativt enkelt sätt att färga maskar, men kräver specifika reagenser och träna för bästa resultat. Kritiska steg (som beskrivs i figur 1) är: 1) glaspreparering (se steg 1 och 2) manuell kompression av nematoder (se steg 2 och 3) snabb fixering (se steg 3). Först, för att maximera vidhäftningen av nematoderna till bilderna, är det bäst att förbereda bilder med hög molek…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable