Antikor boyamasında<em> C. Elegans</em> "Freeze-Cracking kullanma"
Summary
"Freeze-kırma," nematod C iç dokuları sergilemek için bir yöntem protein lokalizasyonu için antikorlara elegans, gösterilmiştir.
Abstract
C leke antikorlar ile elegans, nispeten geçirimsiz manikür kimyasal veya mekanik yöntemlerle atlanmalıdır. "Freeze-çatlama" fiziksel, iki yapışık slaytlar arasındaki nematod sıkıştırarak onları dondurma, ve ayrı slaytlar çekerek nematodlardan manikür çekmek için kullanılan bir yöntemdir. Dondurarak çatlama kimyasal muamele olmadan dokulara erişmek için basit ve hızlı bir yol sağlar ve fiksatif çeşitli kullanılabilir. Ancak, bu örneklerin birçok kaybına yol açar ve gerekli sıkıştırma mekanik olarak örnek deforme eder. Pratikte iyi bir morfolojisi olan numunelerin kurtarma en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Dondurarak çatlama özel sabitleme koşulları, numune kazanımı veya düşük spesifik olmayan boyama için optimize edilmiş, ancak tüm parametreler için aynı anda olabilir. Çok sert sabitleme koşulları gerektiren ve kimyasal manikür permeabilize için gerekli kimyasal tedaviler, Arıtma tahammül antikorlarınçözelti içinde sağlam nematodların t tercih edilebilir. Antikor hafif bir düzeltme gerektiren veya optimum sabitleme koşulları bilinmediği takdirde, dondurularak çatlama hızlı bir antikor ve tahlil, ilgi konusu antijen için spesifik hücre içi ve hücre lokalizasyonu bilgi verebilir çok yararlı bir şekilde kalmasını sağlar.
Introduction
Proteinlerin hücre ve hücre içi lokalizasyonu belirlemek için, bilim adamları, belirli geleneksel özellikle 1 proteinleri tanıyan seçilmiş antikorlar ile dokuların etiketli var. C gibi bazı model organizmalar elegans, antikor boyama, genellikle daha hızlı sonuç moleküler genetik teknikler ile değiştirilmiştir. Bunlar, promotör ve ilgi ve yeşil floresan protein geninin kodlama bölgeleri arasında gen füzyonlarının oluşan yapıları ile transforme organizmaları içerir. Bununla birlikte, moleküler teknikler doğru promotör ve yüksek kopya sayısında (C. elegans alışılmış teknikler) 2,3 at yapıları ifadesindeki değişiklikler bilerek ile ilgili sorunlar gibi eşyaların, bir dizi tabidir. Bu nedenle, antikorlarla boyama in vivo protein işlevi araştırmalarında pek çok bilim adamı için bir hedef olmaya devam etmektedir.
Antikorları ile dokular boyandığında, zor olabilir çünkü birantikorlarının verilmesinin sadece belirli bir konformasyonda 1 kendi antijeni tanıyabilir. Örneğin, antikorlar belirli bir şekilde sabit, sadece denatüre ya da sağlam antijeni tanıyabilir ve yerinde antijeni tanımayabilir. Nematod antikor lekelenme problemi nematodun kütikül dokulara antikor erişimi engelleme, nispeten geçirimsiz bir bariyer oluşturur gerçeği ile daha da artmaktadır.
C. antikor lekeleme için kullanılan birkaç farklı yöntem vardır elegans (önceki çalışmaları gözden 4). Sağlam leke 'solucan' yöntemleri donma ve nispeten sert sabitleştirici (formaldehit ya da glutaraldehit) olarak çözülme geliştirildi; donma-çözülme döngüleri sabitleyici 5 hızlı nüfuz etmesini sağlamak için manikür çatlamak yardımcı. Yöntem maddeler, kolajenaz ya da her ikisi 5-7 azaltılması ile tedavisi dahil, tespit edildikten sonra, kütikül antikorun girmesine izin vermek üzere permeabilize edilmiştir. Bu treatments morfolojisi korunmuş, ancak genellikle antikor tanınmasını azalır ya da yok. Alternatif yöntemler, antikor girmesine izin vermek üzere diseksiyon 8 içerir.
"Freeze-kırma" Antikor 9-10 boyama sağlamak için yarı sağlam solucan iç kısmına erişmek için bir yoldur. Kollajenaz ve azaltma tedavisini kaçınarak Freeze-çatlama tespit çeşitli koşullar ile yapılabilir. Nematodlar, iki yapıştırıcı slaytlar arasında yerleştirilmiş dondurulur ve daha sonra slaytlar ayrılır, alt slayt üzerinde nematod çoğu ve üst kızak üzerindeki kütikül çok ayrılıyor. Alt sürgü sabitleyici yerleştirilebilir ve yapışık nematodlar ile tüm kaydırma antikor lekeleme prosedürü aracılığıyla aktarılır. Yöntem mevcut iki büyük zorluklar yok. İlk olarak, bu ciddi bunları deforme olmadan nematod bölmek için gerekli olan basınç, doğru miktarda uygulamak zordur. İkinci olarak, solucanların çok s olmazya slayt kene ve sabitleştirici veya durular kaybolur. Ancak, uygun slaytlar ve uygulama ile, yöntem, hızlı bir şekilde tespit ediciler ve antikorların çeşitli kullanılabilir makul bir morfolojisi olan nematodlar verecektir.
Yöntem, deneyci amacına bağlı olarak, biraz değiştirilebilir. Tek bir nematod boyama (örneğin, tek bir transformant antikoru boyamasını değişmiş olup olmadığını belirlemek için) isteniyorsa, o zaman maksimum yapışma ile slaytlar (ancak yüksek bir arka plan boyaması) (aşağıya bakınız) bu tür ilave polilisin ile laboratuarda hazırlanmış slaytlar olarak kullanılabilir. Nematodlar, bu tespitler sonra polilisin daha zayıf bağlı Başlangıcı formaldehid veya glutaraldehid tespit için, daha yüksek bir yapışma slaytlar (laboratuar hazırlanan slaytlar polilisin) kullanılmalıdır. Vahşi tip nematodları, metanol ve / veya aseton ile tespit edilmektedir, daha sonra daha düşük bir yapışma özelliğine sahip slaytlar ve alt arka plan boyaması kullanılmalıdır (ticari veya l) slaytlar aboratory hazırlanmış. Antikorlar ve fiksatif çeşitli laboratuarda kullanılıyorsa, slaytlar bir seçim vaktinden önce hazırlanabilir ve gerekli olana kadar saklanır.
Nematod dokuya erişim elde edilmiştir sonra, antikor, boyama işlemleri (daha uzun dokuların karakteristik inkubasyon yerine hücreleri 1,11) ile standart yöntemler takip edin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dondurularak-kırma protokol C antikor lekelemesi için çeşitli yöntemlerden biridir elegans. Bu solucanlar leke için nispeten basit bir yol sağlar, ancak belirli reaktifler gerektiren ve optimum sonuçlar için pratik yapar. (Şekil 1'de) Kritik adımlar şunlardır: 1) slayt hazırlama () adım 3 (bkz. adım 2 ve 3) hızlı tespiti (bkz. adım 1 ve nematod 2) elle sıkıştırma bkz. İlk olarak, slaytlara nematodların yapışmasını en üst düzeye çıkarmak için, bunun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fonlama NSF CCLI # 0633618 ve Ohio Üniversitesi tarafından sağlandı. Bazı suşları Caenorhabditis Genetiği Merkezi tarafindan temin edilmiştir. Lisansüstü öğrenci Reetobrata Basu video görüntülenir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
References
- Harlow, E., Lane, D. . Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).
- Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
- Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook. , (2006).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans. Development. 117, 1071-1087 (1993).
- Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).
- Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line. Development. 120, 2901-2911 (1994).
- Strome, S., Wood, W. B. Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).
- Albertson, D. G. Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos. Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).
- Harlow, E. . Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. WormBook. , (2006).
