Antikörperfärbung in<em> C. Elegans</em> Mit der "Freeze--Cracking"

Summary

"Freeze-Cracking", ein Verfahren zur Freilegung der inneren Gewebe des Nematoden C. elegans, um Antikörper für die Proteinlokalisierung, wird demonstriert.

Abstract

Um C. Fleck elegans mit Antikörpern müssen die relativ undurchlässig Kutikula durch chemische oder mechanische Verfahren umgangen werden. "Freeze-Cracking" ist eine Methode verwendet, um körperlich ziehen Sie die Nagelhaut von Nematoden durch Komprimieren Nematoden zwischen zwei haftenden Folien, Einfrieren, und ziehen Sie die Folien auseinander. Gefrier Cracken liefert eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Zugang zu den Geweben ohne chemische Behandlung erhalten und kann mit einer Vielzahl von Fixiermitteln verwendet werden. Sie führt aber zum Verlust von vielen der Proben und die erforderliche Kompression der Probe mechanisch verformt. Praxis ist erforderlich, um Rückgewinnung der Proben mit guter Morphologie zu maximieren. Gefrier Cracken kann für bestimmte Fixierbedingungen, Rückgewinnung der Proben oder niedrige nicht-spezifische Färbung optimiert werden, aber nicht für alle Parameter auf einmal. Für Antikörper, die sehr schwer Fixierung Bedingungen erfordern und tolerieren die chemischen Behandlungen erforderlich, um chemisch permeabilisieren die Nagelhaut, treatment intakter Nematoden in Lösung bevorzugt werden. Wenn der Antikörper erfordert eine leichtere Lösung oder, wenn die optimale Fixierung Bedingungen bekannt sind, bietet gefrier Cracken eine sehr nützliche Methode, um schnell zu testen, die den Antikörper und spezifische subzelluläre und zelluläre Lokalisation Information für das Antigen von Interesse zu ergeben.

Introduction

Um die zellulären und subzellulären Lokalisation von Proteinen zu bestimmen, haben Wissenschaftler traditionell mit Antikörpern ausgewählt, um bestimmte Proteine ​​spezifisch erkennen, ^ein markierter Gewebe. In einigen Modellorganismen wie C. elegans, Antikörperfärbung wurde oft durch molekulargenetische Techniken, die Ergebnisse schneller erzielen ersetzt. Diese umfassen die Umwandlung Organismen mit Konstrukten aus Genfusionen zwischen dem Promotor und der codierenden Regionen des Gens von Interesse und das grün fluoreszierende Protein. Jedoch unterliegen einer Anzahl von Artefakten, einschließlich der Probleme mit Kenntnis der wahren Promotor und Veränderungen in der Expression von Konstrukten mit hoher Kopienzahl (die üblichen Techniken in C. elegans) ^2,3 molekularen Techniken. Daher Färbung mit Antikörpern bleibt ein Ziel für viele Wissenschaftler, die Proteinfunktion in vivo.

Anfärben mit Antikörpern Gewebe kann schwierig sein, da eineAntikörpern kann nur ihre Antigen in einer bestimmten Konformation ¹ zu erkennen. Zum Beispiel können Antikörper nur denaturiert oder intakten Antigen fixiert in einer bestimmten Weise zu erkennen und nicht das Antigen in situ zu erkennen. Das Problem der Antikörperfärbung in Nematoden wird durch die Tatsache, dass die Kutikula der Nematoden bildet eine relativ undurchlässige Barriere, die Blockierung des Zugangs von Antikörpern gegen Gewebe verstärkt.

Es gibt mehrere verschiedene Methoden für die Antikörper-Färbung verwendet in C. ⁽⁴ in unserer bisherigen Arbeit überprüft) elegans. Um intakte Fleck "Würmer", wurden Methoden entwickelt, zu frieren und tauen in einem relativ harten Fixiermittel (Formaldehyd oder Glutaraldehyd), die Frost-Tau-Zyklen helfen, die Nagelhaut zu knacken, um eine schnelle Durchdringung der Fixiermittel ⁵ zu ermöglichen. Nach der Fixierung wurde die Kutikula permeabilisiert, um das Eindringen der Antikörper zu ermöglichen; Methoden enthalten eine Behandlung mit Reduktionsmitteln, Collagenase oder beides ^5-7. Diese Treatments Morphologie erhalten, aber oft reduziert oder zerstört Antikörpererkennung. Alternative Methoden sind Dissektion ⁸ bis Antikörper Eindringen zu ermöglichen.

"Freeze-Cracking" ist eine Möglichkeit, den Zugang zum Inneren des Halb intakt Wurm gewinnen, damit Antikörperfärbung ^9-10. Gefrier Cracken kann mit einer Vielzahl von Befestigungs Bedingungen durchgeführt werden, während die Vermeidung Kollagenase-und Reduktionsbehandlungen. Die Nematoden sind zwischen zwei Folien gelegt Klebstoffe, gefroren, und dann werden die Folien voneinander getrennt sind, so dass die meisten der Nematode auf der Bodenschieber und viel von der Kutikula auf der oberen Folie. Die untere Folie kann in Fixiermittel gelegt und die gesamte Folie mit haft Nematoden durch den Antikörper Färbeverfahren übertragen. Die Methode hat derzeit zwei große Schwierigkeiten. Erstens ist es schwierig, die richtige Menge von Druck notwendig, um die Nematoden, ohne ernsthaft zu verformen aufgeteilt anzuwenden. Zweitens sind viele der Würmer wird nicht sTick ​​zu jeder Folie, und werden in der Fixiermittel oder Spülungen verloren. Doch mit den richtigen Folien und Praxis wird das Verfahren rasch ergeben Nematoden mit vernünftigen Morphologie, die mit einer Vielzahl von Fixiermittel und Antikörpern verwendet werden kann.

Das Verfahren kann leicht in Abhängigkeit von dem Ziel der Experimentator variiert werden. Wenn Färbung der einzelnen Nematoden erwünscht ist (z. B. um zu bestimmen, ob eine einzelne Transformante wurde Antikörperfärbung verändert), gleitet dann mit maximaler Haftung (aber höhere Hintergrundfärbung) verwendet werden können, wie Labor hergestellte Folien mit zusätzlichen Polylysin (siehe unten). Für Formaldehyd oder Glutaraldehyd-Fixierung, sollte höher Adhäsions-Objektträger (Labor vorbereitet Polylysin Dias) verwendet werden, da Nematoden mehr haften schlecht auf Polylysin nach diesen Fixierungen. Wenn Wildtyp-Nematoden werden mit Methanol und / oder Aceton fixiert, gleitet dann mit geringerer Haftung und geringer Hintergrundfärbung verwendet werden sollte (kommerziell oder labor vorbereiteten Folien). Wenn eine Vielzahl von Antikörpern und Fixiermittel werden im Labor verwendet werden, kann eine Auswahl von Folien voraus hergestellt und gelagert, bis sie benötigt werden.

Nach dem Zugriff auf die Nematoden-Gewebe wurde gewonnen, Antikörperfärbung Verfahren folgen Standardverfahren (mit längeren Inkubationszeiten Merkmal von Geweben statt Zellen ^1,11).

Protocol

HINWEIS: Mehrere Protokollschritte sind mit Optionen für die Einrichtung und Vorbereitung abhängig von den spezifischen Bedingungen des Experiments vorgestellt. Für diese Fälle sind alternative Schritte A, B, C usw. dargestellt Das Protokoll mit alternativen Schritte ist in Fig. 1 skizziert. 1. Vorbereitung von Polylysin beschichtete Objektträger Drei verschiedene Arten von Folien verwendet werden können, abhängig von dem gewünscht…

Representative Results

Wenn Würmer richtig komprimiert, rissig, und leicht fixiert ist, kann nahezu die gesamte Schnecken zugänglich Antikörper-Färbung (siehe Abbildung 2). Die Lage der Kerne durch DAPI-Färbung angezeigt anzeigt, welche Teile der Schnecke sind intakt, wenn die Würmer zu einem härteren Fixiermittel wie Formaldehyd ausgesetzt wird, kann sich die Morphologie der Schnecke verzerrt werden (wie durch die unnatürlich wellige Aussehen der gesehen Muskeln in den Fig. 3A-D). Ein weiteres häufi…

Discussion

Das gefrierCrack Protokoll ist eines von mehreren Verfahren zur Antikörperfärbung in C. elegans. Es bietet eine relativ einfache Möglichkeit, Würmer Fleck, erfordert aber spezifische Reagenzien und Praxis für optimale Ergebnisse. Kritische Schritte (in Abbildung 1 dargestellt) umfassen: 1) Bei Objektträgervorbereitung (siehe Schritte 1 und 2) manuelle Kompression der Nematoden (siehe Schritte 2 und 3) schnelle Fixierung (siehe Schritt 3). Erstens, um die Haftung der Nematoden auf die Obje…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable