Vi introducerer en protokol til generering af store tal (tusind til flere hundrede tusinde) af ensartet størrelse-og sammensætning-kontrollerede tumor spheroids, ved hjælp af kommercielt tilgængelige mikrobrøndsplader.
Tumor spheroids anerkendes i stigende grad som en vigtig in vitro model for opførsel af tumorceller i tre dimensioner. Mere fysiologisk relevant end konventionelle klæbende ark kulturer, de mere præcist rekapitulere og interaktioner stede i reelle tumorer. For at udnytte denne model for bedre at kunne vurdere tumor biologi, eller effekten af nye terapeutiske midler, er det nødvendigt at være i stand til at generere spheroids reproducerbart, på en kontrolleret måde og i betydeligt antal.
Den AggreWell systemet består af et high-density vifte af pyramideformede mikrobrønde, i hvilket en suspension af enkelte celler centrifugeres. Antallet af celler, klynger ved bunden af hver mikrobrønd, og antallet og forholdet mellem forskellige celletyper, der er involveret kun afhænger egenskaberne af suspension, der indføres af eksperimentatoren. Således er vi i stand til at generere tumor spheroids vilkårlige størrelse og sammensætning medud at skulle ændre den underliggende platform teknologi. De hundredvis af mikrobrønde per kvadratcentimeter kultur overfladeareal til gengæld sikre, at ekstremt høje produktionsniveau kan opnås via en enkel, nonlabor-intensiv proces. Vi forventer derfor, at denne protokol vil være stort set nyttigt til forskere i tumoren området klumpformet.
Der er en stigende mængde af beviser, at tumorceller opfører sig anderledes i tredimensionelle kulturer, end de gør, når de dyrkes på plastik, og at terapeutiske midler identificeret på konventionelle cellekultur platforme kan miste effekt, når skiftet til en mere fysiologisk relevant systemet 1.. Det er derfor ønskeligt at undersøge opførslen af kræftceller under disse betingelser, både for at få indblik i deres underliggende biologi, og også at øge succesraten for overgangen nye terapeutiske midler fra screeningen facilitet til klinikken. Et nyttigt modelsystem med en lang historie beskæftiger tredimensionelle klynger af kræftceller er kendt som tumor sfæroider 1,2. Ideelt set ville teknikker til kugleformet dannelse tillade produktion af et stort antal ensartede sfæroider, hvis størrelse og sammensætning styres af eksperimentatoren. Mens hængende-drop og vel-plade nærmer sig 3,4 er i stand til at opfylde nogle af disse rekrav, gennemløb er generelt begrænset, og generering af et stort antal spheroids bliver en arbejdskrævende opgave.
Vi har for nylig udviklet et system til at løse lignende udfordringer i regenerativ medicin felt 5.. Anvender tvunget aggregering i en række af tætpakkede micron skala brønde (se figur 1), er denne fremgangsmåde tillader generering af sfæroider vilkårlige antal af celler, herunder blandinger af flere celletyper 6, samt inkorporering af forskellige biomaterialer 7. Spheroids dannes i stort antal – tusinder til flere hundrede tusinde eller mere – og kan udvindes straks eller holdes i mikrobrøndene, hvor de blev dannet med medium bytte for mindst et 8 til to (upubliceret observation) uger. Dette system er derfor velegnet til generering af et stort antal ensartet og reproducerbar tumor spheroids for vurderingen af effectiveness af nye antitumormidler eller grundlæggende biologiske undersøgelser.
Vi har etableret et system, hvorved et stort antal ensartede spheroids kan genereres fra flere cellelinjer fra forskellige kilder. Vi har endnu ikke mødt en Tilhænger cellelinie, der ikke udgør sphæroider under disse betingelser. Vi har tidligere observeret celle tab i populationer udsat for anoikis 5,8 dog til dato dette problem er ikke opstået med tumorlinjer. Systemet er vilkårligt skalerbart med areal, med adfærd konsistent på tværs af mikrobrønde i 24 brønde og 6-brønds format, såvel som prototype bioreaktorer indeholdende 50.000 mikrobrønde hver øjeblikket under udvikling.
Skulle kugleformet asymmetri være en bekymring, kan inkubationstiden i trin 4.8 øges til to eller tre dage. Spheroids kan også inkuberes i en periode efter ekstraktion fra microwells'ne øge symmetri, men i dette tilfælde skal man være omhyggelig for at holde kultur tætheder tilstrækkelig lav, som spheroids i kontakt med hinanden will ofte smelte sammen til større strukturer. Af denne grund har vi tidligere opretholdt kulturer inden for de mikrobrønde, hvor aggregaterne blev dannet med det primære begrænsning er størrelsen af sfæroidet. Dette vil til gengæld er en funktion af både vækst og indledende str. 8, og hvis udvidede kultur i microwell pladen er planlagt, bør dette overvejes på forhånd. Muligheder for at forhindre tilgroning, bør det ske, omfatter enten starter med mindre spheroids, eller anvender de større mikrobrønde i AggreWell 800 plade.
Skulle sfæroider ikke at stige i sammenhæng over tid, kan en mulig årsag være celledød. Især i større aggregater af stærkt metabolisk aktive celler, kan massetransport begrænsninger på levering af ilt og essentielle næringsstoffer resultere i en nekrotisk kerne 2 – og dermed en ikke-sammenhængende sfæroider kan simpelthen være en følge af overdreven celledød. Alternativt målinger af den mekaniske samdelse af sfæroider er blevet anvendt til at vurdere intercellulære bindingskræfter i forhold til det metastatiske potentiale af en given celle linie 13. Det ville være interessant at undersøge forholdet mellem klumpformet form og metastatisk potentiale, måske ved hjælp af morfometriske parametre som rundhed og omkreds til areal forhold.
Ud over at undersøge de mekaniske og morfometriske egenskaber spheroids, montage i mikrobrønden system giver stor-skala produktion af blandet sammensætning spheroids, bestående af kombinationer af flere celletyper og / eller biomaterialer 6,7. Interaktionerne af tumorceller med andre celletyper er vigtige for tættere modellere adfærd af tumorer in vivo 14, og dermed kan det være af interesse at generere sfæroider fra tumorceller i kombination med fibroblaster og endotelceller, for eksempel. Mikropartikler af forskellige biomaterialer kan også inkorporeres og kan påvirke SPHeroid egenskaber både direkte gennem deres interaktion med celler 7,15, og også som reservoirer til kontrolleret frigivelse af vækstfaktorer og cytokiner i det indre af klumpformet 16.
Hvis der er nogen bekymring sterilitet, for eksempel når du arbejder med en microwell plade, hvor nogle brønde tidligere har været anvendt, der kan have brugt en del tid i en inkubator som en del af et tidligere eksperiment, brøndene kan resteriliseres med 70% ethanol i vand.
Når der er dannet sfæroider, kan de også være adskilt fra resterende inkorporerede celler ved at passere suspensionen over et cellefilter. Individuelle celler vil passere igennem, mens sfæroider vil blive bevaret. Hvis der er mistanke om at kaste potentielt metastatiske celler i løbet af kulturen sfæroiden, kan det være ønskeligt at udføre denne procedure flere gange – i første omgang for at fjerne ikke-inkorporerede celler, og efterfølgende at isolere oprensetd populationer af celler, givet ud fra sfæroiderne.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af University of Calgary, under en ny investigator start-up tilskud til Dr. Ungrin.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
AggreWell 400 plate | StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
Rinsing Solution | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
Cell strainer (37 µm) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
Trypsin-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
Inverted microscope | VWR / Motic | CA19000-610 | |
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
Laminar flow biosafety cabinet | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |