ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

Summary

אנחנו מציגים את פרוטוקול לדור של מספרים גדולים (אלפים למאות אלפים) של-וגודל הספרואידים אחידים בשליטת הרכב גידול, באמצעות צלחות microwell זמינות מסחרי.

Abstract

הספרואידים גידול מוכרים יותר ויותר כמודל חשוב במבחנה להתנהגותם של תאים סרטניים בשלושה ממדים. יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מאשר תרבויות חסיד גיליון קונבנציונליים, הם בצורה מדויקת יותר לסכם את המורכבות ואת האינטראקציות בהווה בגידולים אמיתיים. כדי לרתום את המודל הזה כדי להעריך את הביולוגיה של גידול, או את היעילות של סוכנים טיפוליים חדשניים טוב יותר, יש צורך להיות מסוגל לייצר הספרואידים reproducibly, באופן מבוקר ובמספרים משמעותיים.

מערכת AggreWell מורכבת ממערך צפיפות גבוהה של microwells בצורת הפירמידה, שלתוכו השעיה של תאים בודדים היא centrifuged. מספרם של תאים באשכולות שבתחתית של כל microwell, ואת המספר והיחס בין סוגי תאים שונים המעורבים תלוי רק במאפיינים של ההשעיה הוצגה על ידי הנסיין. לפיכך, אנו מסוגלים לייצר הספרואידים גידול של גודל שרירותי וקומפוזיציה אצלמתוך צורך לשנות את הפלטפורמה טכנולוגית הבסיסית. מאות microwells לסנטימטר רבוע של שטח פן התרבות בתורו להבטיח כי רמות ייצור גבוהות מאוד עשויות להיות מושגת באמצעות תהליך פשוט, nonlabor אינטנסיבי. לכן אנו צופים כי פרוטוקול זה יהיה באופן רחב שימושי לחוקרים בתחום אליפטית הגידול.

Introduction

יש גוף גדל והולך של ראיות לכך שתאי גידול מתנהגים בצורה שונה בשלוש תרבויות ממדים ממה שהם עושים כאשר בתרבית על פלסטיק, וכי סוכנים טיפוליים זוהו על פלטפורמות רקמות תרבות קונבנציונליות עלולים לאבד את היעילות כאשר עברו למערכת יותר מבחינה פיזיולוגית רלוונטית ^1. לכן זה רצוי ללמוד את התנהגותם של תאים סרטניים בתנאים אלה, הן להשיג תובנות הביולוגיה הבסיסית שלהם, וגם כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של מעבר סוכנים טיפוליים חדשים ממתקן ההקרנה למרפאת. מערכת מודל שימושית אחד עם היסטוריה ארוכה מעסיקה אשכולות תלת ממדיים של תאים סרטניים המכונים הספרואידים גידול ^1,2. באופן אידיאלי, טכניקות להיווצרות אליפטית תאפשר ייצור של מספר הגדול של הספרואידים אחידים בגודל ובהרכב נשלטים על ידי הנסיין. בעוד התלייה שחרר וגם צלחת גישות ^3,4 מסוגל למלא את חלק מחדש אלהquirements, תפוקה מוגבלת בדרך כלל, ודור של מספר הגדול של הספרואידים הופכים משימה עתירת עבודה.

יש לנו לאחרונה פיתחו מערכת כדי לפתור אתגרים דומים בתחום רפואת רגנרטיבית ^5. העסקת צבירת כפייה בסדרה של בארות מיקרון בקנה מידה צפופות (ראה איור 1), גישה זו מאפשרת את הדור של הספרואידים ממספרים שרירותיים של תאים, כוללים תערובות של סוגי תאים מרובים ^6, כמו גם שילוב של חומרים ביולוגיים שונים ^7. Spheroids נוצרים במספרים גדולים – אלפי למאות אלפים או יותר – ויכול להיות מופק באופן מיידי או נשמר בmicrowells שבו הם נוצרו עם חילופי בינוניים לאחת לפחות ⁸ שבועיים (תצפית לא פורסם). מערכת זו ולכן גם מתאימה לדור של מספרים גדולים של מדים והספרואידים גידול לשעתק להערכת effectiveness של סוכנים נגד גידולי רומן או חקירות ביולוגיות בסיסיות.

Protocol

הערה: צלחות microwell זמינות בפורמטים שונים, בהתאם לתוצאות הרצויות. מפרט כמו גם הנחיות משוערת למספרי המינימום ומקסימום של תאים שיש להשתמש בכל תבנית מוצגים בטבלה 1. Microwells הקטן יותר להתחדד לנקודה חדה, ולכן אין מגבלת גודל נמוכה יותר, אם כי שונה בין הספרואידים הופך להיות יותר משמעותי בגדלים קטנים יותר. ייצור שיגרתי של הספרואידים מממוצע קטן כמו 20 תאים כל אחד הוא 8 פשוטים. גודל microwell הגדול אינו מחודד באופן מלא, ולכן מנסה ליצור הספרואידים ממספר קטן של תאים עלולים לגרום להספרואידים קטנים מרובים בכל microwell. בשל הבדלים קלים במאפייני שטח, הכנה עם הפתרון פעילי שטח (שלב 1.2) היא לא אופציונלית בעת שימוש בצלחות AggreWell 400Ex. פרוטוקול זה מבוסס על השימוש ב400 צלחות AggreWell – לחסרונות פורמטים אחריםלוח ult 1. מספר התאים להיות טעונים בכל טוב נקבע על ידי הכפלת מספר microwells הוא מכיל במספר התאים שהתקבצו לכל אליפטית. לדוגמה, כדי ליצור הספרואידים מ1000 תאים כל אחד, כל אחד גם חייב להיות עמוס (1,200 הספרואידים פעמים 1,000 תאים כל אחד =) 1.2 x 10 6 תאים. צפיפות תאים חייבת להיות מחושבת בהתחשב בכך שיהיו טעונים התאים בנפח של 0.4 מיליליטר. אז עבור הדוגמא של הספרואידים נוצרו מ1000 תאים כל אחד, 1.2 x 10 6 תאים ב0.4 מיליליטר מתרגם את צפיפות של 3 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. 1. Microwells הכנה לקבלת תאים צלחות microwell הן סטרילי, כפי שנקבע, ויש להסירם רק מהאריזה שלהם בסביבת סטרילית, כגון ארון מינרית זרימת בטיחות ביולוגי. עקרות צריכה להישמר לאורך כל הפרוטוקול. צריכים עקרות להיות בסכנה, בארות resterilized באמצעות 70% אתנול במים באמצעותביצוע שלבים אופציונליים. הוסף 0.5 מיליליטר של אתנול 70% לכל טוב שאינו בשימוש. microwells כמה יהיה בועות אוויר מלכודת, אם כי זה יכול להיות מופחת על ידי הוספת נוזלים בצד אחד, ומאפשר לו להתפשט על פני השטח, ולא שמטו אותו בצורה אנכית על גבי המשטח. החלפת מיכסה. בעוד אדי אתנול צריכים לחדור במהירות כל בועות, אם יש מספרים גדולים זה עשוי להיות רצוי כדי להסיר אותם. צנטריפוגה במשך 2 דקות ב 2,000 x גרם. שים לב שזה חשוב כדי להבטיח את הרוטור מאוזנת כראוי במהירות זו. בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ההגדלה נמוכה, ודאו הוסרו מmicrowells. דגירה במשך 5 דקות עם המכסה על בטמפרטורת חדר. לשאוב אתנול. צלחת החברה ניתן לשטוף עם מים סטריליים או PBS לשימוש מיידי, או אוויר יבש לאחסון. על מנת להבטיח שתאים אינם אינטראקציה עם פני השטח microwell, זה עשוי להיות מוכן באמצעות פעילי שטח. באופן כללי זהמומלץ לבצע שלב זה בתחילה, ולאחר מכן להשוות הספרואידים שנוצרו עם ובלי microwells מצופה פעילי שטח. הוסף 0.5 מיליליטר של שטיפת פתרון היטב כל אחד. microwells כמה יהיה בועות אוויר מלכודת, אם כי זה יכול להיות מופחת על ידי הוספת נוזלים בצד אחד, ומאפשר לו להתפשט על פני השטח, ולא שמטו אותו בצורה אנכית על גבי המשטח. החלפת מיכסה. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 2,000 XG כדי להסיר בועות. שים לב שזה חשוב כדי להבטיח את הרוטור מאוזנת כראוי במהירות זו. בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ההגדלה נמוכה, ודאו הוסרו מmicrowells. דגירה של לפחות חצי שעה עם המכסה על בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 ° C. צלחות עשויות להיות מאוחסנות בארבע מעלות עם הפתרון פעילי שטח בבארות עד צורך אם אטום כראוי כדי למנוע התייבשות. לשטוף צלחת עם מים סטריליים או PBS לפני מייד לשימוש. אל תאפשר צלחותלהתייבש לאחר ציפוי. 2. הכנת תאים הערה: הפרטים של הכנת תא ישתנו במקצת עם נחקר סוג תא המסוים. עם זאת יש לנו ציינו בתנאים אלה על מנת להיות יעילים עם מגוון רחב של תאים, כוללים הקווים שנדונו כאן, כמו גם בתאי גזע עובריים אנושיים ועכבריים (ESC), תאי גזע pluripotent מושרה (iPSC), fibroblasts, האנדודרם פרימיטיווי משוער, ותאי סטרומה. קבוצות אחרות יש מועסקים במערכת זו בהצלחה עבור מגוון רחב של יישומים, כולל chondrogenesis מתאי גזע mesenchymal 9, דור הסטנדרטי של מבשרים עצביים מתאי גזע pluripotent 10, טוקסיקולוגי מנתח בhepatocytes 11 והערכה של התחדשות בחוט השדרה בסלמנדרות 12. הפרוטוקול הספציפי לעבודה עם תאי HT29 מוצג כאן. התחל עם בקבוק T75 של תאי HT29, בתרבית DMEM+ 10% FBS לשאוב בינוני צמיחה מבקבוק, ולהוסיף 3 מיליליטר של טריפסין. דגירה תאים למשך 5 דקות על 37 ° C. תפסיק עיכול טריפסין על ידי הוספת 3 מיליליטר של מדיום גידול. קח aliquot לספירת תאים ולהעביר את השארית לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב200 x גרם. בעוד צנטריפוגה היא בהתקדמות, לספור תאים. טריפסין לשאוב / תערובת בינונית ולהחליף עם מדיום גידול טרי, נקבע על פי נפח צפיפות התאים הנדרש כפי שמחושב לעיל. (אופציונלי) לעבור את ההשעיה התא דרך מסננת על מנת להסיר כל גושים. הערה: תנאי קצירה נייד ישתנו מעט בין השורות. אם פרוטוקול דיסוציאציה לדוגמא passaging התאים של עניין זמין, שאמור לשמש כנקודת התחלה. עם שימוש בשורות תאים רגישים של טריפסין עלול לגרום למוות של תאים מופרזים. במקרים אלה יש לנו ציינו תוצאות טובות באמצעות TrypLE כdissociati אלטרנטיביעל מגיב 8. אם התאים הופכים בכבדים במהלך ניתוק ולאבד את יכולת הקיום, תוספת של DNAse לפתרון האנזים עשויה לפתור בעיה זו. צמצום זמני ניתוק והעסקת צעד טחינה דקה כדי לשבור את גושי תא יכול גם להגביר את הכדאיות. 3. כינונה אליפטית הערה: spheroids עלול להיווצר במגוון של ניסוחים בינוניים, צריכים להתבצע ניסויים ראשוניים זאת תוך שימוש במדיום שבו התאים בתרבית, כדי להבדיל את ההשלכות של מעבר למערכת תרבות 3 ממדים מהשלכות של שינוי הרכב בינוני. הוספת 0.4 מיליליטר של מדיום גידול היטב כל אחד. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 2,000 XG כדי להסיר בועות. שים לב שזה חשוב כדי להבטיח את הרוטור מאוזנת כראוי במהירות זו לפני צנטריפוגה. בועות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה ההגדלה נמוכה, ודאו הוסרו מmicrowells. הוספת 0.4 מיליליטרהשעיה תא בצפיפות הנדרשת (מחושב לעיל). לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה, ללא החדרת בועות אוויר אל תוך microwells. זה חשוב כדי להבטיח שהתאים מתחלקים באופן שווה לאורך כל טוב, על מנת לקבל הספרואידים עקביים. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב200 x גרם. אם הצלחת לא ברמה עצמית במהלך צנטריפוגה, זרמי הסעה עלולים להתעורר תוצאה שבחלוקה לא שווה של תאים על פני microwells. לכן, הצלחת צריכה להיות מאוזנת באופן פנימי, כמו גם על הצלחת אחרת, כך שהמשקל מחולק באופן שווה על שני הצדדים של ספק הצלחת. שים לב: אם ראיות של חלוקת תא אחידה נראית, זה עשוי להיות נחוץ כדי להחיל כמות קטנה של שימון לנקודות הציר בספק צלחת – להתייעץ עם יצרן צנטריפוגות לקבלת הוראות. הערה: ברגע שהתאים כבר centrifuged לmicrowells, הם מתנ סבירtant לכביסה מ תנועות קלות של הצלחת. יש להימנע מתנועות פתאומיות שתגרומנה ניפוצים בינוניים, אבל ההעברה של הצלחת מצנטריפוגות למיקרוסקופ או חממה לא צריכה לגרום לתזוזה של תאים משמעותיים. באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, ודא כי תאים שהתקבצו בתוך microwells, ושהם מחולקים באופן שווה על פני הבאר. דגירה הלילה בשעה 37 ° C. באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, לצפות בתהליך של היווצרות אליפטית. שורות תאים מסוימות יהוו הספרואידים קומפקטיים בתוך 24 שעות, אחרים עשויים להימשך זמן רב יותר. ההתקדמות מאשכול כדי לצבור בתאי HT29 מוצגת באיור 2. לשחזר הספרואידים מmicrowells ולהעביר לתרבות השעיה בעדינות על ידי jetting אותם עם טפטפת. לחלופין, לשמור הספרואידים באתרו עם החלפה בינונית 8 – משך הזמן תלוי בגודלם הראשוני ושיעור צמיחה, אשר define הזמן עד שהם מתגברים על microwells שבו הם נוצרו. כדי להחליף בינוני מבלי לאבד הספרואידים, בינוניים לשאוב בקצה של באר בעזרת פיפטה פסטר. לאט לאט מביא את הקצה למטה עד שהוא מתחיל לצייר נוזל מהמניסקוס, ובצע את המניסקוס למטה כפי שהוא יורד. לאחר מכן להוסיף בינוני טרי על הקיר גם באותו המקום. כמה הספרואידים עלולים ללכת לאיבוד, אך אם מדיום הוא תמיד נשאף, והוחלף באותה התנוחה, את המספר הזה יישאר קטן בהשוואה למספרים הגדולים בבאר.

Representative Results

Spheroids מהקווים גידול מרובים של מקורות אנטומיים שונים זו עשוי בקלות להיות שנוצר ומופק בתרבות השעיה. איור 3 ממחיש את השליטה העקבית גודל בר השגה באמצעות שיטה זו, עם אוכלוסיות אליפטית אחידות מאוד בכל תנאי. הבדלים בין קו ברורים בהתנהגות הם גם נראים, בתאי סרטן המעי הגס HT29 ותאי סרטן הוושט TE6 להרכיב הספרואידים צפופים עם גבולות ברורים וחדים, ואילו תאי סרטן ערמונית LNCaP הולידו הספרואידים פחות קוהרנטית עם גבולות לא סדירים (ראה דיון לסיבות אפשריות ). הכוחות הפנימיים חזקים באגרגטים קוהרנטית יותר, הביאה גם לקריסת צורה סימטרית יותר אפילו בעודו בmicrowells שבו הם נוצרו, ואילו אגרגטים LNCaP, במיוחד בגודל הגדול יותר, בעליל לשמר את הגיאומטריה מרובעת פירמידה של microwells. הקשר בין מספרי תא קלט והחינוך הגופניים גודל iCal של אליפטית וכתוצאה מכך יהיה תלוי במספר משתנה. כרכים תיאורטי המבוססים על המוצר של הנפח לכל תא ואת מספר התאים המועסקים עשויים להיות מופחתים על ידי אובדן תא, אשר בתורו עשוי לכלול אובדן של תאים בשלב ההשעיה התא בודד, כמו גם הפסד מאגרגטים יתר על המידה קטנים בשל מספרים מספקים של שכנים, ומאגרגטים גדולים יתר על המידה כתוצאה מהובלת מגבלות ונימקו בליבה. גם גודל יהיה מושפע מכל התפשטות שעלולה להתרחש במהלך תהליך הצבירה. כפרמטרים אלה ישתנו משורת תאים לשורת תאים, אם הספרואידים של ממדים פיזיים ספציפיים רצויים המספר הנכון של תאים להציג חייב להיקבע באופן ניסיוני. כקירוב ראשון, קוטר אליפטית צפוי לגדול עם השורש השלישי של מספר התאים המשולבים – למשל עלייה של פי 8 במספר התאים צריכה לגרום להכפלת קוטר אליפטית. _content "עבור: together.within-לשמור על עמודים =" תמיד "> איור 1. סכמטי של ייצור אליפטית. מערכת microwell מורכבת ממערך של microwells מרובע פירמידה צפופה (625 לכל 2 סנטימטר לגודל מטר 400 μ), שלתוכו תאים עשויים להיות centrifuged. התאים הם הביאו יחד על ידי הצדדיים המשופעים, ואת גודל אליפטית וכתוצאה מכך הוא נשלט על ידי שינוי הצפיפות של ההשעיה התא המועסק. "Src =" 50665fig2highres.jpg / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg "/> איור 2. הרכבה של תאים התקבצו להספרואידים. Spheroids נוצרו משבעה מאה HT29 תאים כל אחד. מייד לאחר צנטריפוגה (א '), תאי מקובצים באופן רופף בתחתית כל microwell. שים לב שהאשכולות מקוזזים באופן אחיד לכיוון הימני התחתונה במקרה זה. זה מקובל בתנאי גדלי אשכול יישארו עקביים במערך. אם הבדלי גודל אשכול משמעותי נראים מצד אחד של המערך לצד השני, ראה באור בשלב 3.5. לאחר דגירה ל24 שעות (ב '), כוחות דבקים אינטר גרמו אשכולות כדי לצבור ויוצרים spheroids קוהרנטי, אשר עשוי להיות מופק לאחר מכן (C). <b r /> איור 3. Spheroids שנוצר בצלחות microwell. Spheroids נוצרו משבעה מאה (A, C, E) או אלף וחמישה מאה (B, D, F) תאי סרטן המעי הגס HT29 (A, B), תאי סרטן ערמונית LNCaP (C, D) או תאי TE6 הוושט סרטן (E, F). שים לב לעקביות של הספרואידים בתוך הכנה, וגם הווריאציה בין שורות תאים – בפרט מצרפי LNCaP הרופפים בהשוואה לHT29 הצפוף יותר ותאי TE6. בר סולם מייצג 200 מיקרומטר. פורמט microwell AggreWell 400 AggreWell 40EX AggreWell 800 רוחב microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm ) 400 400 800 Microwells לסנטימטר 2 625 625 156.25 Microwells בכל טוב 1,200 4,700 300 תאי מינימום לmicrowell * N / N / 2000 תאים מקסימלית לmicrowell * 2,000 2,000 10,000 תאים מינימליים לכל טוב * N / N / 6 x 10 5 תאים מרביים בכל טוב * 2.4 x 10 6 9.4 x 10 6 3 x 10 6 1.1.1 – 70% אתנול (מיליליטר) נפח 0.5 2.0 0.5 1.2.1 – שטיפת פתרון נפח (מיליליטר) 0.5 2.0 0.5 3.2 – preload בינוני נפח (מיליליטר) 0.4 1.6 0.4 3.5 – טעינה נייד נפח (מיליליטר) 0.4 1.6 0.4 * מספרים של תאים לכל microwell הם רק קירוב כערך זה ישתנה עם הגודל של התאים הספציפיים המועסקים, וצריך להיקבע באופן אמפירי טבלת 1. AggreWell אפשרויות ושינויים בפרוטוקול.

Discussion

הקמנו מערכת לפי מספר גדול של הספרואידים אחידים עלול להיווצר משורות תאים מרובות ממקורות שונים. יש לנו עדיין להיתקל בשורת תאים חסיד שאינו יוצר spheroids בתנאים אלה. יש לנו שנצפו קודם לכן אובדן תא באוכלוסיות מועדות לanoikis ^5,8, עם זאת לתאריך הנפקה זו לא התעוררה עם קווי גידול. המערכת היא באופן שרירותי ניתן להרחבה עם שטח פנים, עם התנהגות עקבית על פני microwells ב24 גם בפורמט 6 היטב, כמו גם ביוריאקטורים אב טיפוס המכילים 50,000 microwells כל כיום בפיתוח.

צריך אליפטית אסימטריה להיות דאגה, זמן הדגירה בשלב 4.8 ניתן להעלות את שניים או שלושה ימים. Spheroids יכול להיות גם טופח במשך התקופה שלאחר חילוץ מmicrowells להגדיל את הסימטריה, אך במקרה זה יש להקפיד כדי לשמור על צפיפות התרבות נמוכה מספיק, כהספרואידים במגע עם אחד wi אחרll לעתים קרובות למזג לתוך מבנים גדולים יותר. מסיבה זו, יש לנו לשמור בעבר תרבויות בתוך microwells בי המצרפים נוצרו, עם המגבלה העיקרית להיות בגודל של אליפטית. זה בתורו הוא פונקציה של שיעור צמיחה והן בגודל ההתחלתי ^8, ואם התרבות המורחבת בתוך צלחת microwell מתוכננת, זה צריך להיחשב מראש. אפשרויות כדי למנוע צמיחת יתר, אם יתרחשו, כוללות מתחילות גם עם הספרואידים קטנים יותר, או העסקת microwells הגדול יותר של צלחת AggreWell 800.

צריכים הספרואידים מצליחים להגדיל בעקביות לאורך זמן, סיבה אחת אפשרית עשויה להיות מוות של תאים. במיוחד באגרגטים גדולים יותר של תאים מאוד פעילים מטבולית, מגבלות תחבורה המוניות באספקת חמצן וחומרים מזינים חיוניים יכולות לגרום לליבת נימקי ² – כך אליפטית שאינו מגובש עשוי להיות פשוט תוצאה של מות תאים מופרז. לחלופין, מדידות של cohe המכנישיאון של הספרואידים כבר שימש להערכת כוחות המחייבים בין תאית, במערכת יחסים לפוטנציאל גרורתי של קו תא נתון ^13. יהיה מעניין לחקור את הקשר בין צורה אליפטית ופוטנציאל גרורתי, אולי באמצעות פרמטרים morphometric כגון עגלגלות והיקפית ליחס אזור.

בנוסף חוקר את התכונות מכאניות וmorphometric של הספרואידים, הרכבה במערכת microwell מאפשרת ייצור בקנה מידה גדולה של הספרואידים מעורב הרכב, בהיקף של שילובים של סוגי תאים מרובים ו / או חומרים ביולוגיים ^6,7. האינטראקציות של תאים סרטניים עם תאים מסוגים אחרים הן חשובות למודל באופן הדוק יותר את התנהגותם של גידולי in vivo ^14, ובכך שהוא עשוי להיות עניין של ליצור הספרואידים מתאי גידול בשילוב עם fibroblasts ותאי האנדותל, למשל. Microparticles של חומרים ביולוגיים שונים עלול גם להיות משולב, והוא יכול להשפיע SPHמאפייני eroid הן ישירות דרך האינטראקציות שלהם עם תאים ^7,15, וגם כמאגרים לשחרור המבוקר של גורמי גדילה וציטוקינים לתוך הפנים של ¹⁶ אליפטית.

אם יש חשש לעקרות, לדוגמא כאשר עובדים עם צלחת microwell שבעבר השתמשו בכמה בארות, שייתכן שבילתה קצת זמן בחממה כחלק מניסוי קודם, הבארות ניתן resterilized עם אתנול 70% במים.

ברגע שהספרואידים נוצרו, הם יכולים גם להיות מופרדים מהתאים מאוגדים השיורי על ידי העברת ההשעיה מעל מסננת תא. תאים בודדים יעברו, ואילו הספרואידים יישמרו. אם אליפטית חשודה בשפיכת תאי פוטנציאל גרורתי במהלך התרבות, זה עשוי להיות רצוי לבצע פעולה זו מספר פעמים – תחילה להסרת תאים מאוגדים, ולאחר מכן לבודד purifieאוכלוסיות ד של התאים ניתנו הנחה על ידי הספרואידים.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
AggreWell 400 plate	StemCell Technologies Inc.	27845/27945
Rinsing Solution	StemCell Technologies Inc.	07010
Cell strainer (37 µm)	StemCell Technologies Inc.	27215
PBS	VWR / LONZA	CA12001-676
Trypsin-Versene (EDTA)	VWR / LONZA	CA12001-660
DMEM	VWR / LONZA	CA12002-212
FBS	VWR / LONZA	CA-95042-112
TrypLE	Invitrogen / Life Technologies	12605010
Inverted microscope	VWR / Motic	CA19000-610
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates	VWR / Beckman	CABKA99465, CABK369704, CABK392806
Laminar flow biosafety cabinet	ESBE / Baker	BKR-SG603AHEUVSP