हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microwell प्लेट का उपयोग कर, समान आकार और संरचना के नियंत्रण वाले ट्यूमर spheroids की (हजारों की सैकड़ों करने के लिए हजारों) बड़ी संख्या की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल परिचय.
ट्यूमर spheroids तेजी से तीन आयामों में ट्यूमर कोशिकाओं के व्यवहार के लिए एक महत्वपूर्ण में इन विट्रो मॉडल के रूप में पहचाने जाते हैं. अधिक physiologically प्रासंगिक पारंपरिक पक्षपाती पत्र संस्कृतियों से, वे और अधिक सही जटिलता और असली ट्यूमर में मौजूद बातचीत पुनरावृत्ति. बेहतर ट्यूमर जीव विज्ञान, या उपन्यास चिकित्सीय एजेंट की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस मॉडल का दोहन करने के लिए, यह एक नियंत्रित तरीके से और बड़ी संख्या में, reproducibly spheroids उत्पन्न करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक है.
AggreWell प्रणाली एकल कक्षों के निलंबन centrifuged है जो में पिरामिड के आकार microwells की एक उच्च घनत्व सरणी के होते हैं. कोशिकाओं की संख्या प्रत्येक microwell के तल पर क्लस्टरिंग, और इसमें शामिल अलग प्रकार की कोशिकाओं की संख्या और अनुपात प्रयोगकर्ता द्वारा शुरू निलंबन के गुणों पर ही निर्भर करते हैं. इस प्रकार, हम साथ मनमाना आकार और संरचना का ट्यूमर spheroids उत्पन्न करने में सक्षम हैंअंतर्निहित प्रौद्योगिकी मंच को संशोधित करने की आवश्यकता होगी, बाहर. बदले में संस्कृति सतह क्षेत्र के प्रति वर्ग सेंटीमीटर microwells के सैकड़ों अत्यंत उच्च उत्पादन के स्तर को एक सरल, nonlabor गहन प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करें. इसलिए हम इस प्रोटोकॉल ट्यूमर उपगोल क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए मोटे तौर पर उपयोगी हो जाएगा उम्मीद है.
ट्यूमर कोशिकाओं को एक अधिक physiologically प्रासंगिक प्रणाली 1 में परिवर्तित जब पारंपरिक ऊतक संस्कृति प्लेटफार्मों पर पहचान की चिकित्सीय एजेंट प्रभावकारिता खो सकते हैं कि वे जब प्लास्टिक पर संवर्धित कर की तुलना में तीन आयामी संस्कृतियों में अलग तरीके से व्यवहार, और कहा कि सबूत के एक बढ़ती शरीर है. यह दोनों अपनी अंतर्निहित जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, इन परिस्थितियों में कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, और भी क्लिनिक के लिए स्क्रीनिंग की सुविधा से नए चिकित्सीय एजेंट संक्रमण की सफलता की दर को बढ़ाने के लिए इसलिए भी जरूरी है. एक लंबा इतिहास के साथ एक उपयोगी मॉडल प्रणाली ट्यूमर spheroids 1,2 के रूप में जाना जाता कैंसर कोशिकाओं के तीन आयामी समूहों को रोजगार. आदर्श रूप में, अंडाकार आकृति गठन के लिए तकनीक जिसका आकार और संरचना प्रयोगकर्ता के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं वर्दी spheroids की बड़ी संख्या के उत्पादन की अनुमति होगी. फांसी ड्रॉप और अच्छी तरह से थाली दृष्टिकोण जबकि 3,4 इन फिर से कुछ को पूरा करने में सक्षम हैंquirements, throughput आम तौर पर सीमित है, और spheroids की बड़ी संख्या की पीढ़ी एक श्रम प्रधान कार्य हो जाता है.
हमने हाल पुनर्योजी चिकित्सा क्षेत्र 5 में इसी तरह की चुनौतियों को हल करने के लिए एक प्रणाली विकसित की है. (चित्रा 1 देखें) घनी पैक माइक्रोन पैमाने कुओं की एक श्रृंखला के भीतर मजबूर एकत्रीकरण रोजगार, इस दृष्टिकोण अनेक प्रकार की कोशिकाओं 6 का मिश्रण है, साथ ही विभिन्न biomaterials 7 के समावेश सहित कोशिकाओं का मनमाना संख्या से spheroids पीढ़ी के परमिट. हजारों या अधिक के सैकड़ों के लिए हजारों – – spheroids बड़ी संख्या में गठन कर रहे हैं और तुरंत निकाले या वे दो (अप्रकाशित अवलोकन) सप्ताह के लिए कम से कम एक 8 के लिए मध्यम मुद्रा के साथ गठन किया गया जिसमें microwells में बनाए रखा जा सकता है. इस प्रणाली इसलिए अच्छी तरह से प्रभावी तरीके के आकलन के लिए वर्दी की बड़ी संख्या और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर spheroids की पीढ़ी के लिए अनुकूल हैउपन्यास अर्बुदरोधी एजेंटों या बुनियादी जैविक जांच की ctiveness.
हम वर्दी spheroids की बड़ी संख्या को विभिन्न स्रोतों से कई सेल लाइनों से उत्पन्न हो सकता है, जिसके तहत एक ऐसी प्रणाली की स्थापना की है. हम इन परिस्थितियों में spheroids फार्म नहीं करता है कि एक पक्षपाती सेल लाइन का सामना करने के लिए अभी तक है. हम पहले हालांकि तारीख को इस मुद्दे ट्यूमर लाइनों के साथ पैदा हुई नहीं है, anoikis 5,8 होने का खतरा आबादी में सेल नुकसान मनाया है. प्रणाली 24 अच्छी तरह से और 6 अच्छी तरह से प्रारूप है, साथ ही वर्तमान में विकास के तहत 50,000 microwells प्रत्येक युक्त प्रोटोटाइप बायोरिएक्टर में microwells भर में लगातार व्यवहार के साथ, सतह क्षेत्र के साथ मनमाने ढंग से स्केलेबल है.
विषमता एक चिंता का विषय हो उपगोल चाहिए, कदम 4.8 में ऊष्मायन समय दो या तीन दिनों के लिए बढ़ाया जा सकता है. Spheroids भी हालांकि इस मामले में ख्याल एक दूसरे वाई के साथ संपर्क में spheroids के रूप में पर्याप्त रूप से कम संस्कृति घनत्व रखने के लिए लिया जाना चाहिए, समरूपता बढ़ाने के लिए microwells से निकासी के बाद एक अवधि के लिए incubated किया जा सकता हैकरूँगा अक्सर व्यापक ढांचे में फ्यूज. इस कारण से, हम पहले से समुच्चय प्राथमिक सीमा अंडाकार आकृति का आकार होने के साथ गठन किया गया जिसमें microwells भीतर संस्कृतियों को बनाए रखा है. यह बदले में वृद्धि दर और प्रारंभिक आकार 8 दोनों का एक समारोह है, और microwell प्लेट के भीतर बढ़ाया संस्कृति की योजना बनाई है, तो यह पहले से विचार किया जाना चाहिए. अतिवृद्धि को रोकने के लिए विकल्प है, यह हो जाना चाहिए, छोटे spheroids की शुरुआत के साथ, या AggreWell 800 प्लेट का बड़ा microwells रोजगार या तो शामिल हैं.
Spheroids समय के साथ जुटना में वृद्धि करने में विफल चाहिए, एक संभावित कारण कोशिका मृत्यु हो सकती है. विशेष रूप से अत्यधिक metabolically सक्रिय कोशिकाओं का बड़ा समुच्चय में, ऑक्सीजन और आवश्यक पोषक तत्वों के वितरण पर जन परिवहन सीमाओं एक परिगलित कोर 2 में परिणाम कर सकते हैं – इस प्रकार एक गैर एकजुट उपगोल बस अत्यधिक कोशिका मृत्यु का एक परिणाम हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, यांत्रिक cohe की मापspheroids के सायन एक दिया सेल लाइन 13 के metastatic क्षमता के संबंध में, कहनेवाला बंधन बलों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह शायद इस तरह के क्षेत्र अनुपात को गोलाई और परिधि के रूप में morphometric मापदंडों का उपयोग, अंडाकार आकृति आकार और metastatic क्षमता के बीच संबंध की जांच करने के लिए दिलचस्प होगा.
Spheroids के यांत्रिक और morphometric संपत्तियों की जांच करने के अलावा, microwell प्रणाली में विधानसभा अनेक प्रकार की कोशिकाओं और / या biomaterials 6,7 के संयोजन से मिलकर मिश्रित रचना spheroids का बड़े पैमाने पर उत्पादन परमिट. अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत इस प्रकार यह उदाहरण के लिए, fibroblasts और endothelial कोशिकाओं के साथ संयोजन में ट्यूमर कोशिकाओं से spheroids उत्पन्न करने के लिए ब्याज की हो सकती है, और अधिक बारीकी से विवो 14 में ट्यूमर के व्यवहार मॉडल के लिए महत्वपूर्ण हैं. विभिन्न biomaterials के microparticles भी शामिल किया जा सकता है, और SPH प्रभावित कर सकते हैंसीधे कोशिकाओं 7,15, और भी उपगोल 16 के इंटीरियर में वृद्धि कारकों और साइटोकिन्स के नियंत्रित रिहाई के लिए जलाशयों के रूप में के साथ उनकी बातचीत के माध्यम से दोनों eroid गुण.
बाँझपन के बारे में कोई चिंता नहीं है, तो पिछले एक प्रयोग के हिस्से के रूप में एक मशीन में कुछ समय खर्च हो सकता है कि कुछ कुओं पहले से इस्तेमाल किया गया है, जिसमें एक microwell प्लेट, के साथ काम करते हैं, उदाहरण के लिए, कुओं 70% इथेनॉल के साथ resterilized किया जा सकता है पानी में.
Spheroids का गठन किया गया है, वे भी एक सेल छलनी पर निलंबन गुजर द्वारा अवशिष्ट अनिगमित कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है. Spheroids बनाए रखा जाएगा, जबकि व्यक्ति की कोशिकाओं, के माध्यम से समाप्त हो जाएगी. उपगोल संस्कृति के पाठ्यक्रम पर संभावित metastatic कोशिकाओं बहा का संदेह है, तो यह इस प्रक्रिया को कई बार प्रदर्शन करने के लिए वांछनीय हो सकता है – शुरू में अनिगमित कोशिकाओं को दूर करने के लिए, और बाद में purifie अलग करने के लिएकोशिकाओं के विकास आबादी spheroids से उतर दिया.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के डॉ. Ungrin के लिए एक नई अन्वेषक शुरू हुआ अनुदान के तहत, कैलगरी विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
AggreWell 400 plate | StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
Rinsing Solution | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
Cell strainer (37 µm) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
Trypsin-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
Inverted microscope | VWR / Motic | CA19000-610 | |
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
Laminar flow biosafety cabinet | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |