우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다.
종양 상체 점점 입체적으로 종양 세포의 거동에 대한 중요한 시험 관내 모델로서 인식된다. 더 생리학 관련 기존 접착 시트의 문화에 비해, 그들은 더 정확하게 복잡성과 실제 종양에 존재하는 상호 작용을 요점을 되풀이하다. 나은 종양 생물학, 또는 신규 치료제의 효능을 평가하기 위하여,이 모델을 활용하기 위해서는, 제어 된 방식과 상당수에서 재현성 상체를 생성 할 수있을 것이 필요하다.
AggreWell 시스템은 단일 세포 현탁액을 원심으로하는 피라미드 형 마이크로 웰의 고밀도 배열로 구성된다. 세포의 숫자는 각 마이크로 웰의 바닥에 클러스터링 및 관련된 뚜렷한 세포 유형의 수와의 비율은 실험에 의해 도입 현탁액의 속성에만 의존한다. 따라서, 우리는 함께 임의의 크기와 구성의 종양 상체를 생성 할 수 있습니다기본 플랫폼 기술을 수정할 필요가 부족합니다. 차례 문화 면적의 제곱 센티미터 당 마이크로 웰의 수백 매우 높은 생산 수준이 간단, nonlabor 많이 사용하는 프로세스를 통해 달성 될 수 있다는 것을 확인합니다. 따라서 우리는이 프로토콜은 종양 구형 분야의 연구자에 크게 도움이 될 것으로 기대합니다.
종양 세포가 더 생리 학적으로 관련 시스템 1로 전환하면 기존의 조직 문화 플랫폼에서 확인 된 치료제가 효능을 잃을 수 있다는 것을 그들이 때 플라스틱 배양보다 입체 문화에서 다르게 행동하고, 증거의 증가 몸이있다. 그것은 모두 그들의 내부 생물학에 대한 통찰력을 얻기 위해, 이러한 조건 하에서 암 세포의 거동을 연구하기 위해, 또한 병원에 검사 시설에서 새로운 치료제를 전환의 성공률을 증가시키는 것이 바람직하다. 긴 역사를 가진 하나의 유용한 모델 시스템은 종양 상체 1,2로 알려진 암 세포의 3 차원 클러스터를 사용합니다. 이상적으로, 구형 형성 기술은 크기와 구성 실험자에 의해 제어되는 균일 한 상체의 큰 숫자의 생산을 허용하는 것입니다. 매달려 드롭 잘 플레이트에 접근하는 동안 3,4이 다시 중 일부를 수행 할 수 있습니다요건, 처리는 일반적으로 제한되며, 상체 많은 수의 생성은 노동 집약적 인 작업이됩니다.
우리는 최근에 재생 의학 분야 5 유사한 문제를 해결할 수있는 시스템을 개발했습니다. (도 1 참조) 밀집 마이크론 스케일 웰 시리즈 내의 강제 응집을 이용하는이 방법은 여러 종류의 세포 (6)의 혼합물뿐만 아니라 다양한 생체 물질 (7)의 혼입을 포함한 세포의 임의의 번호로부터 상체의 생성을 허용한다. 수천 이상 수백 수천 – – 상체가 다수 형성되어 즉시 추출하거나 두 (미발표 관찰) 주 적어도 하나 08 배지 교환에 형성되는 마이크로 웰에서 유지 될 수있다. 이 시스템은 따라서 잘 EFFE의 평가를 위해 균일 한 많은 수의 재생 가능한 종양 상체의 생성에 적합새로운 항 종양 제 또는 기본적인 생물학적 조사 ctiveness.
우리는 균일 한 회전 타원체 많은 수의 서로 다른 소스에서 여러 개의 세포주에서 생성되도록하는 시스템을 구축했다. 우리는이 상태에서 상체를 형성하지 않는 부착 세포주가 발생할 못하고있다. 우리는 이전하지만 현재까지이 문제가 종양 라인을 제기하지 않은, anoikis 5,8하는 경향이 인구의 세포 손실을 관찰했다. 이 시스템은 24 웰과 6 자 형식뿐만 아니라 현재 개발중인 50,000 마이크로 웰을 각각 포함 된 프로토 타입의 생물 반응기에서 마이크로 웰 일관된 행동, 표면적 임의로 확장 성이다.
비대칭 우려 타원체 있으면, 단계 4.8에서 배양 시간은 2-3 일까지 증가 될 수있다. 구 상체는 또한 그러나이 경우 치료가 서로 WI 접촉 상체로서, 충분히 낮은 배양 밀도를 유지하기 위해 취해야, 대칭성을 증가시키는 마이크로 웰로부터 추출 후 기간 동안 배양 될 수있다LL 종종 더 큰 구조로 융합. 이러한 이유로, 우리는 이전에 골재가 일차 제한 타원체의 크기되는, 형성되는 마이크로 웰 내에 배양을 유지하고있다. 이것은 차례로 성장 속도 및 초기 크기 (8)의 함수이며, 마이크로 웰 플레이트 내에서 연장 배양 계획되는 경우, 이것은 사전에 고려되어야한다. 증식을 방지하는 옵션이 발생한다은 작은 상체로 시작하는, 또는 AggreWell 800 판의 큰 마이크로 웰을 사용 하나 있습니다.
상체가 시간이 지남에 일관성이 증가하지 않을 경우, 하나의 잠재적 원인은 세포의 죽음이 될 수있다. 특히 고도의 대사 활성 세포의 큰 집계에 산소와 필수 영양소의 전달에 대량 전송 제한이 괴사 코어 2 발생할 수 있습니다 – 따라서 비 응집 된 구형은 단순히 과도한 세포 죽음의 결과 일 수있다. 대안으로, 기계적 COHE 잼상체의 시온은 주어진 셀 라인 (13)의 전이 가능성의 관계에서, 세포 간 결합력을 평가하는 데 사용되었습니다. 이는 아마도 이러한 면적비 진원도 및 경계로 형태 학적 파라미터를 사용하여, 회전 타원체 형상 및 전이성 전위 사이의 관계를 조사하기 위해 흥미로울 것이다.
상체의 기계적 및 형태 학적 특성을 조사하는 것 외에도, 마이크로 웰 시스템 어셈블리는 여러 세포 유형 및 / 또는 6,7 생체 재료의 조합으로 이루어지는 혼합 조성물 상체의 대규모 생산을 허용한다. 다른 세포 유형의 종양 세포의 상호 작용에 따라서는 예를 들어, 섬유 아세포 및 내피 세포와 함께 종양 세포에서 상체를 생성하는 데 관심이있을 수 있으며, 더 자세히 생체 (14)에서 종양의 동작을 모델링하는 것이 중요하다. 각종 생체 물질의 미립자도 혼입 될 수 있고, SPH 영향을 미칠 수있다직접 세포 7,15, 또한 회전 타원체 (16)의 내부로 성장 인자 및 사이토 카인의 방출 제어를위한 저수지로와의 상호 작용을 통해 모두 eroid 속성.
불임에 대한 우려가있는 경우 이전 실험의 일환으로 인큐베이터에 약간의 시간을 보냈습니다 수있는 몇 가지 우물이 이전에 사용되어있는 마이크로 웰 플레이트, 작업을 할 때, 예를 들어, 우물 70 % 에탄올로 resterilized 할 수있다 물.
상체가 형성되고 나면, 이들은 또한 셀 스트레이너 위에 현탁액을 통과시켜 잔류 비법 세포로부터 분리 될 수있다. 상체가 유지됩니다 동안 개별 세포를 통해 전달합니다. 구형이 배양 과정 동안 잠재적 전이성 세포를 흘리는 것으로 의심되는 경우,이 절차를 여러 번 수행하는 것이 바람직 할 수있다 – 처음 비법 세포를 제거하고,이어서 purifie을 격리세포의 D 인구는 상체으로 해제가 없습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 박사 Ungrin에 대한 새로운 조사 시동 부여에서 캘거리 대학에 의해 투자되었다.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
AggreWell 400 plate | StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
Rinsing Solution | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
Cell strainer (37 µm) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
Trypsin-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
Inverted microscope | VWR / Motic | CA19000-610 | |
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
Laminar flow biosafety cabinet | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |