Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado.
Esferóides de tumor são cada vez mais reconhecido como uma importante modelo in vitro para o comportamento de células de tumor em três dimensões. Mais fisiologicamente relevante do que as culturas convencionais aderente folhas, eles recapitular com mais precisão a complexidade e as interações presentes em tumores reais. A fim de utilizar este modelo para avaliar melhor a biologia do tumor, ou a eficácia de novos agentes terapêuticos, é necessário ser capaz de gerar esferóides de forma reprodutível, de uma maneira controlada e em números significativos.
O sistema AggreWell consiste de uma matriz de alta densidade de micropoços em forma de pirâmide, em que uma suspensão de células isoladas é centrifugado. Os números de células de agrupamento, na parte inferior de cada micropoço, e o número e proporção de diferentes tipos de células envolvidas dependem apenas das propriedades da suspensão introduzida pelo experimentador. Assim, somos capazes de gerar esferóides tumor de tamanho e composição arbitrária coma necessidade de modificar a tecnologia de plataforma subjacente. As centenas de micropoços por centímetro quadrado de superfície da cultura, por sua vez garantir que os níveis de produção extremamente elevados podem ser alcançados através de um processo intensivo de nonlabor simples. Esperamos, portanto, que este protocolo será de grande utilidade para pesquisadores da área esferóide tumor.
Existe um crescente corpo de evidências de que as células tumorais se comportam de forma diferente em três culturas tridimensionais do que quando cultivadas em plástico, e que os agentes terapêuticos identificados em plataformas de cultura de tecidos convencionais podem perder eficácia quando a transição para um sistema mais fisiologicamente relevantes 1. É desejável, portanto, para estudar o comportamento de células cancerosas sob estas condições, ambos os a perceber melhor a sua biologia subjacente, e também para aumentar a taxa de sucesso de transição de novos agentes terapêuticos a partir da instalação de rastreio para a clínica. Um sistema de modelo de utilidade, com uma longa história emprega aglomerados tridimensionais das células cancerosas conhecidas como esferóides tumorais 1,2. Idealmente, as técnicas para formação de esferóide iria permitir a produção de grandes números de esferóides uniformes, cuja dimensão e composição são controladas pelo experimentador. Enquanto pendurado soltar e bem-plate aproxima 3,4 são capazes de cumprir algumas dessas resitos, o rendimento é geralmente limitado, e geração de um grande número de esferóides se torna uma tarefa trabalhosa.
Recentemente, desenvolveu um sistema para resolver desafios semelhantes no campo da medicina regenerativa 5. Empregando agregação forçada dentro de uma série de poços em escala mícron densamente compactados (ver Figura 1), esta abordagem permite a produção de esferóides de números arbitrários de células, incluindo misturas de vários tipos de células 6, bem como a incorporação de vários biomateriais 7. Esferóides são formados em grande número – milhares de centenas de milhares ou mais – e pode ser extraído imediatamente ou mantidas nos micropoços em que foram formados com troca de meio por pelo menos um 8 a dois (observação não publicada) semanas. Este sistema é, portanto, bem adequado para a geração de um grande número de uniforme e esferóides tumorais reprodutíveis para a avaliação da effectiveness de novos agentes antitumorais ou investigações biológicas básicas.
Nós estabelecemos um sistema em que um grande número de esferóides uniformes podem ser gerados a partir de múltiplas linhagens de células de diferentes fontes. Temos ainda encontrar uma linha de células aderentes que não formam esferóides sob estas condições. Nós já observamos perda de células em populações sujeitas a anoikis 5,8, no entanto até o momento esta questão não surgiu com linhagens tumorais. O sistema é escalonável arbitrariamente com a área de superfície, com o comportamento consistente em micropoços de 24 poços e formato de 6 poços, bem como bioreactores protótipo contendo 50.000 micropoços cada actualmente em desenvolvimento.
Deve esferóides assimetria ser uma preocupação, o tempo de incubação no passo 4.8 pode ser aumentada para dois ou três dias. Esferóides também pode ser incubada por um período de, após extracção a partir dos micropoços, para aumentar a simetria, no entanto, neste caso, deve ser tomado cuidado para manter as densidades de cultura suficientemente baixo, como esferóides em contacto um com o outro will muitas vezes se fundem em estruturas maiores. Por este motivo, já anteriormente mantidas culturas dentro dos micropoços em que foram formados os agregados, com a principal limitação é o tamanho do esferóide. Este por sua vez é uma função tanto da taxa de crescimento e o tamanho inicial 8, e se a cultura alargada dentro da microplaca está prevista, esta deve ser considerada com antecedência. Opções para evitar crescimento excessivo, se ocorrer, incluir ou começando com esferóides menores, ou empregando os micropoços maiores da placa AggreWell 800.
Deve esferóides não conseguem aumentar a coerência ao longo do tempo, uma causa potencial pode ser a morte da célula. Particularmente em grandes agregados de células altamente metabolicamente ativas, as limitações de transporte de massa sobre o fornecimento de oxigênio e nutrientes essenciais pode resultar em um núcleo necrótico 2 – portanto, um esferóide não coeso pode ser simplesmente uma conseqüência da morte excessiva de células. Alternativamente, medições da coesão mecânicação de esferóides foram usadas para avaliar a forças de ligação intercelular, em relação com o potencial metastático de uma dada linha de células 13. Seria interessante investigar a relação entre a forma esferóide e potencial metastático, talvez usando parâmetros morfométricos como arredondamento e perímetro para razão de área.
Além de investigar as propriedades mecânicas e morfométricas de esferóides, a montagem do sistema de micropoços permite a produção em larga escala de esferóides mista de composição, que consiste em combinações de vários tipos e / ou de biomateriais 6,7 celulares. As interacções de células tumorais com outros tipos de células é importante para modelar mais de perto o comportamento de tumores in vivo 14, por isso, pode ser de interesse para gerar esferóides de células tumorais em combinação com os fibroblastos e células endoteliais, por exemplo. As micropartículas de vários biomateriais também pode ser incorporado, e pode afectar a esfPropriedades eroid tanto directamente, através das suas interacções com células 7,15, e também como reservatórios para a libertação controlada de factores de crescimento e citocinas para o interior do esferóide 16.
Se houver qualquer preocupação com a esterilidade, por exemplo quando se trabalha com uma microplaca em que alguns poços já foram usados, que podem ter passado algum tempo em uma incubadora, como parte de um experimento anterior, os poços podem ser reesterilizado com etanol 70% na água.
Uma vez que os esferóides foram formadas, elas podem também ser separadas das células não incorporados residuais por passagem da suspensão ao longo de um filtro de células. As células individuais vai passar, enquanto os esferóides será retida. Se o esferóide é suspeito de derramamento de células potencialmente metastático ao longo do curso da cultura, pode ser desejável para realizar este procedimento várias vezes – inicialmente para remover as células não incorporados, e subsequentemente para isolar purified populações das células fora dado por esferóides.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela Universidade de Calgary, no âmbito de um novo investigador arranque concessão ao Dr. Ungrin.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
AggreWell 400 plate | StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
Rinsing Solution | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
Cell strainer (37 µm) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
Trypsin-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
Inverted microscope | VWR / Motic | CA19000-610 | |
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
Laminar flow biosafety cabinet | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |