Vi inför ett protokoll för generering av ett stort antal (tusentals till hundratusentals) av samma storlek-och kompositionsstyrda tumör sfäroider, med hjälp av kommersiellt tillgängliga mikroplattor.
Tumör spheroids erkänns alltmer som en viktig modell in vitro för beteendet hos tumörceller i tre dimensioner. Mer fysiologiskt relevant än konventionella kulturer vidhäftande ark, de mer exakt rekapitulera komplexiteten och samspelet som finns i verkliga tumörer. För att utnyttja denna modell för att bättre bedöma tumörbiologi, eller effekten av nya läkemedel, är det nödvändigt att kunna generera spheroids reproducerbart, på ett kontrollerat sätt och i betydande antal.
Den AggreWell systemet består av en hög densitet matris av pyramidformade mikrobrunnar, i vilken en suspension av enstaka celler centrifugeras. Antalet celler klustring vid botten av varje brunn, och antalet och förhållandet av distinkta celltyper som deltar beror endast på egenskaperna hos suspensionen som införs genom den som utför experimentet. Således kan vi generera tumör sfäroider av godtycklig storlek och sammansättning medut att behöva ändra den underliggande plattformsteknologi. De hundratals mikrobrunnar per kvadratcentimeter av odlingsytan i sin tur att säkerställa att extremt höga produktionsnivåer kan uppnås via en okomplicerad, nonlabor intensiv process. Vi räknar därför med att detta protokoll kommer att vara i stort sett användbar för forskare i tumören spheroid fältet.
Det finns en ökande mängd bevis för att tumörceller beter sig olika i tredimensionella kulturer än de gör när de odlas på plast, och det terapeutiska medel som identifierats på konventionella vävnadskulturplattformar kan förlora effekt när övergått till ett mer fysiologiskt relevant systemet 1. Det är därför önskvärt att studera hur cancerceller under dessa förhållanden, både för att få insikt i deras bakomliggande biologi, och även för att öka andelen framgångsrika övergång nya terapeutiska medel från screeningen anläggningen till kliniken. En användbar modellsystem med en lång historia sysselsätter tredimensionella kluster av cancerceller som kallas tumör sfäroider 1,2. Helst skulle tekniker för sfäroid bildning medger produktion av ett stort antal enhetliga spheroids vars storlek och sammansättning styrs av försöksledaren. Medan hängande-släpp och väl-plattan närmar sig 3,4 har möjlighet att uppfylla en del av dessa rekrav, genomströmningen är i allmänhet begränsad, samt generering av ett stort antal spheroids blir en arbetsintensiv uppgift.
Vi har nyligen utvecklat ett system för att lösa liknande problem i regenerativ medicin fält 5. Anställa tvingas aggregering inom en rad tätt packade mikrometerstorlek brunnar (se figur 1), medger detta tillvägagångssätt generering av sfäroider från godtyckliga antal celler, inbegripet blandningar av flera celltyper 6, samt införlivandet av olika biomaterial 7. Sfäroider bildas i stort antal – tusentals till hundratusentals eller flera – och kan extraheras omedelbart eller bibehållas i mikrobrunnarna i vilket de bildade med mediumutbyte i minst en 8 till två (opublicerad observation) veckor. Detta system är därför väl lämpad för generering av ett stort antal enhetliga och reproducerbara tumör spheroids för bedömningen av effectiveness av nya antitumörmedel eller grundläggande biologiska undersökningar.
Vi har etablerat ett system där ett stort antal enhetliga spheroids kan genereras från flera cellinjer från olika källor. Vi har ännu inte stöta på en vidhäftande cellinje som inte bildar spheroids under dessa förhållanden. Vi har tidigare observerat cellförlust i populationer utsatta för anoikis 5,8, men hittills i fråga har inte uppkommit med tumörlinjer. Systemet är godtyckligt skalbar med ytan, med uppförande konsekvent mellan mikrobrunnar i 24-väl och 6 brunnar, samt prototyp bioreaktorer innehållande 50.000 mikrobrunnar var närvarande under utveckling.
Bör Sfäroid asymmetri vara ett bekymmer, kan inkubationstiden i steg 4.8 ökas till två eller tre dagar. Spheroids kan även inkuberas under en period efter extraktion från mikrobrunnarna för att öka symmetrin, men i detta fall måste man se till att hålla odlingstätheten är tillräckligt låg, som sfäroider i kontakt med varandra will ofta smälter samman till större strukturer. Av den anledningen har vi tidigare underhålls kulturer inom mikrobrunnarna där aggregaten bildades, med det primära begränsningen är storleken på sfäroid. Detta i sin tur är en funktion av både tillväxt och initial storlek 8, och om förlängd kultur inom mikrobrunnsplattan planeras, bör detta beaktas i förväg. Alternativ för att förhindra igenväxning, om den uppstår, inkluderar antingen starta med mindre sfäroider, eller anställa de större mikrobrunnarna i AggreWell 800 plattan.
Bör sfäroider misslyckas med att öka i överensstämmelse med tiden, kan en potentiell orsak vara celldöd. Särskilt i större aggregat av mycket metaboliskt aktiva celler, kan begränsningar masstransport på leveransen av syre och näringsämnen resultera i en nekrotisk kärna 2 – alltså en icke-sammanhängande sfäroid kan helt enkelt vara en följd av överdriven celldöd. Alternativt kan mätningar av den mekaniska sammanhållsionen av sfäroider har använts för att utvärdera intercellulära bindningskrafter, i relation till den metastatiska potentialen hos en viss cell-linje 13. Det skulle vara intressant att undersöka förhållandet mellan sfäroid form och metastatisk potential, kanske med hjälp av morfometriska parametrar som rundhet och omkrets areaförhållande till.
Förutom att undersöka de mekaniska och morfometriska egenskaper spheroids, montering i mikrosystemet möjliggör storskalig produktion av blandad sammansättning sfäroider, som består av kombinationer av flera typer och / eller biomaterial 6,7 cell. De interaktioner av tumörceller med andra celltyper som är viktiga för att närmare simulera beteendet hos tumörer in vivo 14 och därigenom kan det vara av intresse för att generera sfäroider från tumörceller i kombination med fibroblaster och endotelceller, till exempel. Mikropartiklar av olika biomaterial kan även införlivas, och kan påverka sferoid egenskaper både direkt genom deras interaktioner med celler 7,15, och även som behållare för kontrollerad frisättning av tillväxtfaktorer och cytokiner i det inre av den sfäroid 16.
Om det finns någon oro för sterilitet, exempelvis när man arbetar med en mikrobrunnsplatta i vilken vissa brunnar har tidigare använts, som kan ha tillbringat en tid i en inkubator som en del av ett tidigare experiment, brunnarna kan steriliseras med 70% etanol i vatten.
När sfäroider har bildats, kan de också separeras från kvarvarande icke-registrerade celler genom att passera suspensionen över en cell sil. Individuella celler kommer att passera genom, medan sfäroiderna kommer att bevaras. Om sfäroiden misstänks sprider potentiellt metastaserande celler under loppet av kulturen, kan det vara önskvärt att utföra den här proceduren flera gånger – först för att avlägsna icke etablerade celler, och därefter isolera purified populationer av celler som avges från sfäroiderna.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av University of Calgary, enligt en ny utredare startpeng till Dr Ungrin.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
AggreWell 400 plate | StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
Rinsing Solution | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
Cell strainer (37 µm) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
Trypsin-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
Inverted microscope | VWR / Motic | CA19000-610 | |
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
Laminar flow biosafety cabinet | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |