Kwantificering van de Respiratory Burst Response als een indicator van het aangeboren immuunsysteem Gezondheid in zebravis
Summary
De aangeboren immuunrespons beschermt organismen tegen pathogene infectie. Een essentieel onderdeel van de aangeboren immuunrespons, de fagocyt respiratory burst, genereert reactieve zuurstofradicalen die binnendringende micro-organismen te doden. We beschrijven een respiratoire burst test die reactieve zuurstofradicalen geproduceerd wanneer de aangeboren immuunrespons chemisch geïnduceerd kwantificeert.
Abstract
De fagocyt respiratoire burst is onderdeel van de aangeboren immuunrespons op pathogene infectie en omvat de productie van reactieve zuurstof species (ROS). ROS zijn giftig en functie om phagocytized micro-organismen te doden. In vivo kwantificatie van-fagocytensysteem afgeleide ROS biedt informatie met betrekking tot het vermogen van een organisme om een robuuste aangeboren immuunrespons. Hier beschrijven we een protocol te kwantificeren en te vergelijken ROS geheel zebravis embryo's bij chemische inductie van de fagocytensysteem respiratory burst. Deze methode maakt gebruik van een niet-fluorescente verbinding die fluorescerende op oxidatie door ROS wordt. Individuele zebravis embryo's worden gepipetteerd in de putjes van een microtiterplaat en geïncubeerd in deze fluorogene substraat met of zonder chemische inductor van de respiratoire burst. Fluorescentie in elk putje wordt gekwantificeerd op gewenste tijdstippen met behulp van een microplaatlezer. Fluorescentie metingen worden aangepast aan de achtergrond fluorescentie te elimineren en vervolgens compared met een ongepaarde t-test. Deze methode maakt vergelijking van de respiratoire uitbarsting potentieel van zebravis embryo's op verschillende ontwikkelingsstadia en in reactie op experimentele manipulaties zoals proteïne knockdown, overexpressie, of behandeling met farmacologische agentia. Deze methode kan ook worden gebruikt om de respiratoire burst reactie geheel ontleed nieren of celpreparaten uit nieren van volwassen zebravissen en andere vissoorten volgen. Wij geloven dat de relatieve eenvoud en het aanpassingsvermogen van dit protocol bestaande protocollen zal aanvullen en van belang zijn voor onderzoekers die proberen om beter inzicht in de aangeboren immuunrespons zullen zijn.
Introduction
Het immuunsysteem bestaat uit twee takken: aangeboren en adaptieve immuniteit. Aangeboren immuniteit evolutionair veel ouder dan adaptieve immuniteit. Ongewervelde dieren zijn momenteel gedacht dat alleen aangeboren immuniteit hebben, terwijl gewervelde dieren bezitten zowel het aangeboren en adaptieve takken. Terwijl adaptieve immuniteit verleent specifieke en langdurige immuniteit voor bepaalde ziekteverwekkers, aangeboren immuniteit is een onmiddellijke reactie op binnendringende bacteriën, virussen en schimmels. Een cruciaal aspect van de aangeboren immuunrespons omvat de afgifte van cytokinen en chemokinen, die resulteert in ontsteking en werving van fagocyten (bijvoorbeeld macrofagen, neutrofielen) te overspoelen en vernietigen vreemde indringers.
Succesvolle aangeboren immuunresponsen omvatten: (1) opname van binnendringende micro-organismen, (2) inductie van de geschikte signalering cascades (bv. afgifte van cytokinen en chemokinen), (3) een goede ontwikkeling / voldoende aantallen fagocyten; (4) Migratie van fagocyten aan plaatsen van infectie (5) afblazen van pathogenen, en (6) vernietiging van micro-organismen overspoeld. Een tekort aan een van deze stappen kunnen leiden tot de gastheer overweldigd door en bezwijken aan de infectie. Een robuuste aangeboren immuunrespons is van vitaal belang voor de gezondheid van organismen, omdat het de eerste lijn van verdediging tegen ziekteverwekkers in alle planten en dieren. In gewervelde dieren, het versterkt ook de adaptieve immuunrespons 1. Daarom is het essentieel dat wij in staat om alle aspecten van de aangeboren immuunrespons evalueren om beter begrijpen en zijn functie te optimaliseren.
Veel model organismen worden gebruikt om aangeboren immuniteit bestuderen, variërend van Arabadopsis naar C. elegans Drosophila aan muizen aan gekweekte menselijke cellen. Een voordeel van het gebruik van de zebravis (Danio rerio) modelsysteem om aangeboren immuniteit bestuderen is dat de zebravis is een gewerveld dier, met zowel aangeboren en adaptieve imschap, maar de ontwikkeling van aangeboren en adaptieve immuniteit zijn tijdelijk gescheiden. Zebravis uitsluitend op aangeboren immuniteit voor bescherming tegen infectie tot adaptieve immuniteit wordt volledig functioneel, die ongeveer 4-6 weken na de bevruchting 2 optreedt. Naast de gereedschappen voor genetische manipulatie, optische helderheid en snelle, externe ontwikkeling, aangeboren immuniteit als het principe wijze van verweer in de zebravis embryo's biedt een vereenvoudigd model waarin om de complexiteit van de aangeboren immuunrespons in vivo te bestuderen.
Meerdere protocollen ontwikkeld om verschillende aspecten van de aangeboren immuunrespons in zebravis embryo's te beoordelen. Microarrays en RNAseq hebben gevalideerd dat de cytokine profielen uitgelokt door de zebravis aangeboren immuunrespons zijn vergelijkbaar met die van mensen en hebben ook voorgesteld de betrokkenheid van onverwachte genen bij aangeboren immuniteit 3,4. De transparantie van de zebravis embryo en tl, transgeneic stammen van ziekteverwekkers en zebravis mogelijk maken visualisatie van dynamische gastheer-pathogeen interacties in vivo in real time. Transgene zebravis embryo GFP onder controle van de neutrofiel-specifieke promoter myeloperoxidase 5,6 of macrofaag-specifieke promotor MPEG1 7 hebben het mogelijk te visualiseren en kwantificeren fagocyt migratie naar gebieden van gelokaliseerde infecties 8 alsmede fagocytose en vernietiging van zichtbaar gemaakt fluorescent gelabelde pathogenen 8,9. Zebravis embryo's zijn ook ontvankelijk voor het genereren van hoog-assays en chemische schermen. Dienovereenkomstig, high-throughput methoden transcriptoomanalyse na infectie 10 en fagocytensysteem migratie naar sites van chemisch geïnduceerde schade 11 zijn onlangs ontwikkeld.
Van de hierboven genoemde technieken, geen kwantitatieve beoordeling van de laatste fase van een ziekteverwekker vernietiging door fagocyten. Deze laatste faseomvat een respiratoire burst (productie van ROS en andere giftige stoffen), die overspoeld ziektekiemen te doden. Het enzym NADPH oxidase is een belangrijke bron van ROS in fagocyten. Montage van de subeenheden van het NADPH oxidase enzym leidt tot overdracht van elektronen aan zuurstof, superoxide anionen. Door opeenvolgende enzymatische reacties, superoxide kan vervolgens worden omgezet in waterstofperoxide en hypochloorzuur (Figuur 1A). Het is de respiratoire uitbarsting van fagocyten die ziekteverwekkers doodt en dus de kwantificering van de respiratoire uitbarsting potentieel van zebravis embryo is indicatief voor de algehele gezondheid aangeboren immuunsysteem. We hebben een fluorescentie-gebaseerde test voor de respiratory burst in groepen van afzonderlijke zebravis embryo 12 kwantificeren. Deze test maakt gebruik van de niet-fluorescerende, gereduceerde vorm van een in de handel verkrijgbaar, celpermeable kleurstof. Deze kleurstof, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetaat (H2DCFDA), wordt omgezet in het fluorescent verbinding 2 ', 7'-dichloorfluoresceïne (DCF), na oxidatie. De diverse ROS gegenereerd door de fagocyt respiratory burst kan oxideren H2DCFDA en het genereren van fluorescentie 24. Het uiterlijk van fluorescentie kan worden gebruikt om te kwantificeren en vergelijken respiratory burst reactie tussen groepen zebravis. De proteïne kinase C agonist forbolmyristaatacetaat (PMA) wordt gebruikt om chemisch te induceren NADPH oxidase ROS produceren en verhogen fluorescentie metingen (Figuur 1B). Hierin geven we een gedetailleerd protocol van een aangepaste en geoptimaliseerde versie van deze zebravis embryo ademhalingsuitbarsting assay. Deze test kan worden gebruikt voor het vergelijken van de respiratory burst tussen groepen afzonderlijke zebravis embryo's in de tijd en / of in antwoord op experimentele manipulaties (bijv. morfolino-eiwit gemedieerde knockdown). Het gebruik van deze werkwijze, samen met andere zebravissen aangeboren immuniteit assays, zal een completer beeld van de complexe en kritische biedenaangeboren immuunrespons.
Protocol
Representative Results
Discussion
De primaire functie van fagocyten is pathogenen detecteren overspoelen en vernietigen. Het vermogen van fagocyten om een adequate respiratory burst produceren is essentieel voor deze functie. Aldus kwantificering van de respiratoire burst antwoord is een methode om een vergelijking van algemeen aangeboren immuunsysteem gezondheid en de functie tussen groepen individuen en / of in antwoord op experimentele manipulaties mogelijk. Hier beschrijven we een protocol voor het induceren, kwantificeren en vergelijk d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag naar het verleden en de huidige leden van de Kim laboratorium, Mark Nilan voor zebravis verzorging en onderhoud, dr. Robert Wheeler voor nuttige discussies en uitwisseling van gegevens te erkennen, en NIH subsidies 3RO1GM087308-02S1 en 1P20RR024475-01A2 en de Maine Landbouw en Bosbeheer Experiment Station (publicatienummer 3303) voor financiering.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d’Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘Definitive’ (and ‘Primitive’) Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .
