Et eksempel på en nano lægemiddel baseret på polyæblesyre præsenteres i retning af rationel udformning af skræddersyet medicin, der er gældende for kræft. Det beskriver syntesen af en nano lægemiddel til behandling af HER2-positive humane bryst i en nøgen mus.
Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.
I den post-genome æra, hvor genomer af kræft er blevet bragt i orden (National Center for Biotechnology og The Cancer Genome Atlas), vil fremtidige behandling af kræft tegner sig for den genetiske mangfoldighed af tumorer ofte inden for samme tumor 1-4. Bioinformatik og hurtig, ikke dyrt DNA-sekventering muliggør erhvervelse af maligne gener / mutationer på et personligt plan 2,4,5. Når gener er blevet identificeret, vil patienterne blive behandlet med personlig medicin til at ændre eller lukke munden deres udtryk af maligne gener 6. Behovet for at målrette kræftceller og levere medicin ind i disse celler kræver polyfunktionelle leveringssystemer. Naturligvis kan nano medicin opfylde dette krav 7.
I en bølgende bølge af opdagelser nanopartikler har vist sig egnet til at bringe nyttelast af kemoterapeutiske lægemidler, proteiner og / eller genetisk aktivt materiale til cancerceller. Dog fortsat bivirkninger at være annonceklædt. En af dem i forbindelse med fraværet af bionedbrydelighed kan medføre aflejring af materiale i sundt væv og organer med sandsynlighed for at fremkalde sygdomme. For at minimere aflejring introducerede vi ikke-toksisk og ikke-immunogen polyæblesyre, som er af mikrobiel oprindelse og biologisk nedbrydeligt til H 2 O og CO 2 8. Vi bruger polymer til at syntetisere en alt-i-en kovalent type nano stof. Den indeholder kemisk vedhæftede kemoterapeutika såsom Temozolomide, doxorubicin, eller antisense-oligonukleotider og funktionelle grupper, der serverer ekstravasation, målretning væv, endosomolytic levering. De lægemidler er uløseligt spaltes fra nano-platformen, da de ankom i den målrettede tumor celle, og derved regenerere deres fulde farmaceutisk aktivitet.
Vi beskriver fremgangsmåden for mikrobiel produktion af polymeren nano platform dets oprensning, og den kemiske syntese af en nano lægemiddel, der indeholder trastuzumab (Herceptin) for kræftmålretning og et antisense-oligonukleotid til inhibering af HER2 overproduktion. Ved anvendelse af nano stof til xenogent HER2-positiv brystkræft menneske på nøgne mus, vi viser høj effekt af kræftbehandlingen. Principperne for målretning tumor og gendæmpning introduceret her polyæblesyre nano medicin kan anvendes i behandlingen af andre tilfælde af kræft.
Den eksperimentelle vej til fremstilling af nano medicin fra en bionedbrydelig naturlig polymer præsenteres som kan anvendes i syntesen af personaliseret medicin. Beskrivelsen starter med kontrolleret produktion og oprensning af polyæblesyre, som er en alsidig platform for nano drug syntese. Brug reproducerbare teknikker polymeren opnås med høj molekylvægt og i ekstrem renhed egnet til farmaceutiske synteser. Syntesen er beskrevet for en nano stof, der er vist til effektivt at behandle brystkræft HER2-positiv. Beskrivelsen kan omsættes til synteser af de fleste andre nano lægemidler til behandling af cancer. Målretning involverer antistoffer, såsom Herceptin, som binder et tumor-specifikt antigen, såsom HER2-protein eller en anden tumormarkør, der er effektivt internaliseres. Nano drug leverer et udvalg af antisense-oligonukleotider og kemoterapeutika, som effektivt hæmmer væksten af kræft under threeatment. I eksemplet Herceptin binding til HER2 og specifik antisense oligonukleotidannealing med HER2-kodende mRNA resulterede i vedvarende blokering af HER2-signalering og alvorlig reduktion af brystkræft HER2-positiv. Baseret på den underliggende princip om målretning og hæmning af genekspression ved antisenseoligonukleotider tumor har vi til dato syntetiseret adskillige andre nano narkotika og held hæmmede prækliniske menneskelige glioblastom og brystkræft triple-negative 11,14-18.
Den syntetiske arbejde starter med fremstillingen af højt oprenset nano drug platform, som er polyæblesyre fra kultursupernatanten af Physarum polycephalum (en art af "slimsvamp" familie). Fremstillingen understreger høje molekylvægte af polymeren i princippet muliggør fastgørelse af mange antistoffer, peptider, oligonukleotider og andre molekyler, der fungerer i aktiv drug delivery og hæmning af tumorvæksten. Following kontrolleret dyrkning og rensning, er blevet produceret reproducerbar kvalitet af polymer i forudsigelige udbytter. Polymeren opbevares under praktiske forhold til enhver tid.
Syntesen af PMLA nano konjugater begynder med kemisk aktivering af polymer-vedhæng carboxylater udføres i et par syntetiske trin. Mellem trin, kan syntese placeres valgfrit på hold tillader fremstilling af vilkårlige mængder af mellemprodukter og således kan anvendes i op skalering. Forløbet af syntesen følges ved TLC og sec-HPLC, og både sammensætning og aktivitet af nano lægemidlet styres af gruppe-specifikke kvantitative kemiske assays, ELISA, og en række fysiske målinger. Vores erfaring er, at disse synteser er blevet skredet jævnt og reproducerbart med fremragende udbytter og renhed. Ved at vælge specificitet af antistof og antisenseoligonukleotider enhver variant af nano stof er positivt syntetiseret efter behov i personalized medicin.
De nærmere betingelser for en vellykket behandling af human brystkræft HER2-positiv er gyldige repræsentanter for udarbejdelse af mus kræftmodeller, anvendelse af nano medicin, billedbehandling og analyse af tumorvækst. Resultaterne af in vitro levedygtighed test er nyttige i at vælge den cellelinje og førende lægemiddel, der skal anvendes i dyreforsøg. In vivo Xenogen billeddannelse validerer, at nano stof faktisk er leveret i tumoren. Resultater af western blotting afslører, om niveauet for visse proteiner reagerede i den forudsagte mode under kræftbehandling. Måling af tumorstørrelse informerer om behandlingens succes, dvs omkring hæmning, recession eller regression. Det beskrevne eksempel afspejler vores erfaringer med andre polyæblesyre-baserede nano lægemidler indikerer en høj grad af forudsigelighed, reproducerbarhed og fravær af bemærkelsesværdige toksicitet. De seneste resultater på toksicitet og effekt af flere targeted polyæblesyre konjugater til triple-negativ brystkræft behandling er i stærk støtte af dette begreb 18.. En vigtig funktion er, at vores nano stof er i stand til at trænge bio-barrierer: endotel barriere af ekstravasation i tumoren interstitielle tumoren cellemembran ved endosom optagelse samt endosom membran afbrydelse af virkningen af leucin-ethylester eller trileucine grupper. Ekstravasation og endosome optagelse pålideligt opnås ved de specifikke antistoffer knyttet til nano stof. Anti-muse transferrin receptorantistof medierer effektiv indstrømning i tumoren ved transcytose, sandsynligvis fordi receptoren er overudtrykt i de fleste tumorvaskulatur. Et andet antistof bundet på samme nano konjugatmolekyle funktioner specifikt dirigere nano lægemidlet i modtageren tumorcelle. Tilstedeværelsen af begge antistoffer, er afgørende for optimal funktion en for transcytose og den anden til endosom optagelse. Kvantitativ analyse af mAlic syre og antistof anbefales for at kontrollere optimale sammensætning af nano lægemidlet. Endelig skal det bemærkes, at den alt-i-én kovalente nano drug leverer stof i kemisk vedlagte tilmeldingsblanket undervejs gennem værten karrene i modtagerens tumor celle. Kemisk vedhæftet gør de fleste lægemidler inaktive (prodrugs), indtil de er rekonstitueret som frie lægemidler ved spaltning fra nano konjugat platform på målrettet websted. Dette er vigtigt, fordi reaktivering modalitet giver en høj grad af sikkerhed under leveringen og en minimal chance for at fremkalde skadelige bivirkninger. Alsidighed, effektivitet og sikkerhed er uundværlige egenskaber af god personlig medicin.
The authors have nothing to disclose.
We greatly acknowledge financial support by NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, grants from the Department of Neurosurgery at Cedars-Cedars Medical Center and Arrogene Technology Inc.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine (2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
Herceptin | Genentech | 15534 | |
Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
SPDP | Proteochem | C1116 | |
Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
Dexmedetomidine | Pfizer | ||
Atipamezole | Pfizer | ||
Carprofen | Pfizer | ||
Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |