Ett exempel på en nano läkemedel baserat på polyäppelsyra presenteras mot rationell design av personlig medicin som är tillämplig på cancer. Det beskriver syntesen av en nano läkemedel mot HER2-positive human bröstcancer i en naken mus.
Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.
I den postgenomiska eran då genom av cancer har avslöjad (National Center for Biotechnology och Cancer Genome Atlas), kommer framtida behandling av cancer står för den genetiska mångfalden av tumörer ofta inom samma tumör 1-4. Bioinformatik och snabb, inte dyrt DNA-sekvensering möjliggör förvärv av maligna gener / mutationer på ett personligt plan 2,4,5. När gener har identifierats, ska patienter behandlas med personlig medicin för att ändra eller tysta deras uttryck av maligna gener 6. Behovet av att rikta cancerceller och leverera läkemedel in i dessa celler kräver flerfunktionella leveranssystem. Uppenbarligen kan nano droger uppfylla detta krav 7.
I en svallande våg av upptäckter nanopartiklar har visat sig vara lämpligt att bringa nyttolaster av kemoterapeutiska läkemedel, proteiner och / eller genetiskt aktivt material till cancerceller. Men negativa effekter återstår att annonsenklädd. En av dem i samband med frånvaro av biologisk nedbrytbarhet kan orsaka avsättning av material i frisk vävnad och organ med sannolikheten att framkalla sjukdomar. För att minimera avlagring införde vi icke-toxisk och icke-immunogen polyäppelsyra, som är av mikrobiellt ursprung och biologiskt nedbrytbar till H2O och CO 2 8. Vi använder polymeren för att syntetisera en allt-i-ett kovalent typ av nano drog. Den innehåller kemiskt kopplade kemoterapeutika såsom Temozolomide, doxorubicin, eller antisensoligonukleotider och funktionella grupper som tjänar extravasation, vävnads inriktning endosomolytic leverans. Drogerna är inneboende klyvs från nano-plattform när de kom i den riktade tumörcellen och därigenom regenerera sin fulla läkemedelsverksamhet.
Vi beskriver metoden för mikrobiell framställning av polymeren nano plattformen, dess rening, och den kemiska syntesen av en nano läkemedel som innehåller Trastuzumab (Herceptin) för cancermålinriktning och en antisensoligonukleotid för hämning av HER2-överproduktionen. Vid tillämpning av nano drogen till xenogent mänsklig HER2-positiv bröstcancer på nakna möss, visar vi hög effektivitet av cancerbehandling. Principerna för tumör inriktning och geners uttryck introduceras här för polyäppelsyra nano droger kan användas vid behandling av andra fall av cancer.
Den experimentella väg för framställning av nano läkemedel från en biologiskt nedbrytbar polymer presenteras som kan användas i syntesen av personlig medicin. Beskrivningen startar med den kontrollerade produktionen och reningen av polyäppelsyra, som är en mångsidig plattform för nano läkemedelssyntes. Använda reproducerbara tekniker är den erhållna polymeren med hög molekylvikt och i extrem renhet lämplig för farmaceutiska synteser. Syntesen beskrivs för en nano läkemedel som visat sig effektivt behandla HER2-positiv bröstcancer. Beskrivningen kan översättas till synteser av de flesta andra droger nano för behandling av cancer. Targeting innebär antikroppar såsom Herceptin som binder ett tumörspecifikt antigen såsom HER2 protein eller någon annan tumörmarkör som effektivt intern. Nano drog levererar ett urval av antisens-oligonukleotider och kemoterapeutika som effektivt kommer att inhibera tillväxten av cancern enligt Treatment. I exemplet, Herceptin binder till HER2 och specifik antisenseoligonukleotid glödgning med HER2-kodande mRNA ledde ihållande blockering av HER2-signalering och kraftig minskning av HER2-positiv bröstcancer. Baserat på den underliggande principen för tumör målinriktning och hämning av genexpression genom antisense oligonukleotider har vi uppdaterat syntetiserat flera andra nano droger och framgångsrikt hämmade prekliniska mänskligt glioblastom och trippel-negativ bröstcancer 11,14-18.
Den syntetiska Arbetet inleds med utarbetandet av högt renat nanodrogplattform, vilket är polyäppelsyra från odlingssupernatanten av Physarum polycephalum (en art av "slemsvamp" familj). Framställningen betonar höga molekylvikter för den polymer, i princip gör det möjligt att ansluta olika antikroppar, peptider, oligonukleotider och andra molekyler som fungerar i aktiv läkemedelstillförsel och tumörtillväxthämning. Following kontrollerad odling och rening, har reproducerbar kvalitet av polymer i förutsägbara avkastning producerats. Polymeren lagras under lämpliga förhållanden för någon tid.
Syntesen av PMLA nano konjugat börjar med kemisk aktivering av polymer-hängande karboxylater sker i några syntetiska steg. I mellan stegen, kan syntes valfritt vänt möjliggör beredning av godtyckliga mängder intermediärer och därmed kan användas i upp skalning. Framskridandet av syntesen följs med TLC och SEC-HPLC, och både sammansättning och aktivitet av nano drogen styrs av gruppspecifika kvantitativa kemiska analyser, ELISA, och en variation av fysikaliska mätningar. Vår erfarenhet är att dessa synteser har gått smidigt och reproducerbart med utmärkta utbyten och renhet. Genom att välja specificitet antikropp och antisensoligonukleotider någon variant av nano läkemedel är gynnsamt syntetiseras som behövs i personalized medicin.
Arbetsformerna för framgångsrik behandling av humant HER2-positiv bröstcancer är giltiga representanter för beredning av cancer mus modeller, tillämpning av nano droger, bildbehandling och analys av tumörtillväxt. Resultaten av in vitro-viabilitet tester är användbar i valet av cellinje och det ledande läkemedlet som skall användas i djurexperiment. In vivo Xenogen avbildning validerar att nano läkemedlet verkligen avges till tumören. Resultat av Western blotting avslöjar huruvida nivån av vissa proteiner reagerade i den förutsagda mode under cancerbehandling. Mätningar av tumörstorlek informerar om framgången med behandlingen, dvs om hämning, recession eller regression. Det beskrivna exemplet återspeglar vår erfarenhet med andra polyäppelsyra baserade nano droger tyder på en hög grad av förutsägbarhet, reproducerbarhet och frånvaro av anmärkningsvärd toxicitet. Nya resultat på toxicitet och effekt för flera targeted polyäppelsyra konjugat för trippel-negativ bröstcancer behandling är i starkt stöd för denna uppfattning 18. En viktig egenskap är att vår nano drog kan tränga biologiska hinder: den endothelial barriär genom extravasation in i tumören interstitiell, tumörcellmembran genom endosome upptag, och endosommembransönderbrytning enligt beslut av leucin etylester eller trileucin grupper. Extravasering och endosome upptag tillförlitligt uppnås genom de specifika antikroppar kopplade till nano drogen. Anti-mus transferrinreceptor antikropp förmedlar effektivt tillströmning i tumören genom transcytos, förmodligen för att receptorn är överuttryckt på de flesta tumörkärl. En annan antikropp fäst på samma nano konjugatmolekyl funktioner specifikt rikta nano drogen i mottagaren tumörcellen. Förekomsten av både antikroppar, är det en för transcytos och den andra för endosome upptag, en förutsättning för optimal funktion. Kvantitativ analys av malic syra och antikropp rekommenderas för att kontrollera optimala sammansättningen av nano drogen. Slutligen bör det noteras att den allt-i-ett kovalent nano drog levererar läkemedel i kemiskt bifogade formuläret väg genom värdkärlsystemet i mottagaren tumörcellen. Kemisk infästning gör de flesta läkemedel inaktiva (prodrugs) tills de är färdigberedda som fria läkemedel genom klyvning från nano-konjugat plattformen på den riktade platsen. Detta är viktigt eftersom reaktive modalitet ger en hög grad av säkerhet vid leverans och en minimal chans att framkalla skadliga biverkningar. Mångsidighet, effekt och säkerhet är nödvändiga attribut för god personlig medicin.
The authors have nothing to disclose.
We greatly acknowledge financial support by NIH R01 CA123495, U01 CA151815, R01 CA136841, grants from the Department of Neurosurgery at Cedars-Cedars Medical Center and Arrogene Technology Inc.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine (2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
Herceptin | Genentech | 15534 | |
Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
SPDP | Proteochem | C1116 | |
Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
Dexmedetomidine | Pfizer | ||
Atipamezole | Pfizer | ||
Carprofen | Pfizer | ||
Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |