La inducción farmacológica de la melanina epidérmica y Protección contra las quemaduras solares en un modelo de ratón humanizado

Summary

Melanina epidérmica es inducida por la aplicación tópica de forskolina en un modelo murino de lo humano-UV sensible de piel clara. La manipulación terapéutica de los niveles de AMPc en la piel y el oscurecimiento de la epidermis a proteger firmemente contra la inflamación mediado por UV (quemadura solar) según lo medido por la dosis eritematosa mínima (MED) de ensayo.

Abstract

La equidad de la piel, sensibilidad UV y riesgo de cáncer de piel en todo correlaciona con la función fisiológica del receptor de melanocortina 1, una proteína de señalización T _s acoplado encuentra en la superficie de los melanocitos. Mc1r estimula la adenilciclasa y la producción de cAMP que, a su vez, hasta regula la producción melanocíticos de melanina en la piel. Con el fin de estudiar los mecanismos por los que la señalización Mc1r protege la piel frente a la lesión UV, este estudio se basa en un modelo de ratón con "piel humanizado", basada en la expresión epidérmica de factor de células madre (SCF). Ratones transgénicos K14-Scf conservan melanocitos en la epidermis y por lo tanto tienen la capacidad de depositar la melanina en la epidermis. En este modelo animal, de tipo salvaje resultados del estado Mc1r en la deposición sólida de pigmento eumelanina negro y un fenotipo con protección UV. En cambio, los animales K14-SCF defectuosa señalización Mc1r capacidad presentan una pigmentación rojo / rubio, muy poca eumelanina en la piel yun fenotipo sensible a UV. Razonando que la deposición de eumelanina que se podría mejorar por agentes tópicos que imitan la señalización Mc1r, encontramos que la aplicación directa de extracto de forscolina para la piel de ratones de piel clara Mc1r defectuosa como resultado robusto inducción eumelanina y la protección UV ^1. A continuación se describe el método para la preparación y la aplicación de un extracto de la raíz natural que contiene forskolina a K14-Scf ratones de piel clara, y presentarán un método para medir la sensibilidad UV mediante la determinación de la dosis eritematosa mínima (MED). El uso de este modelo animal, es posible estudiar la forma en la inducción de AMPc epidérmica y melanización de la piel afectan a las respuestas fisiológicas a la exposición UV.

Introduction

La incidencia de melanoma, la forma más mortal de cáncer de piel, se ha incrementado dramáticamente en las últimas décadas en Estados Unidos, sobre todo entre las personas de piel clara. Evidencia molecular y epidemiológico fuerte implica la radiación UV como un importante factor ambiental causante ^2-5. Aumento de la exposición UV en forma de exposición al sol y el uso de camas de bronceado es probable que sea responsable de gran parte de los aumentos en la incidencia de melanoma ^6-7. Riesgo del melanoma parece especialmente vinculado con las quemaduras de sol ^8, sobre todo los primeros años de vida ^9-10. Riesgo de quemaduras de sol no sólo está ligada a la dosis y la intensidad de los rayos UV, sino también por factores hereditarios que influyen en la respuesta cutánea a la radiación UV. Pigmentación de la piel es uno de los determinantes más importantes de la sensibilidad UV, el riesgo de quemaduras solares y el riesgo de cáncer. El melanoma se presenta aproximadamente veinte veces más frecuente en personas de piel clara en comparación con la individualización de piel oscurals ^11-13.

La melanina, un pigmento producido por los melanocitos en la epidermis, es el principal determinante de la tez de la piel. La melanina se presenta en dos variedades principales: (1) eumelanina, un pigmento de color marrón oscuro / negro eficaz en la absorción de la energía de la radiación UV, y (2) feomelanina, un color rojizo / pigmento rubia menos eficaz en la prevención de la penetración de los fotones UV en la piel. Color de la piel, sensibilidad UV y el riesgo de melanoma están determinados en gran medida por el contenido de eumelanina epidérmica ^14-15. El más eumelanina en la epidermis, los menos fotones UV puede penetrar en la piel. Debido a los bajos niveles de la eumelanina innatas, las personas de piel clara son mucho más propensos a los efectos agudos y crónicos de la radiación UV ^16-18.

Pigmentación de la piel, el riesgo de melanoma y la capacidad de "tan" después de la exposición UV todo se correlacionan con la capacidad de señalización de la melanocortina 1 del receptor (Mc1r), un G _s acoplado y siete transmembrana sreceptor urface en melanocitos ^19-22. Cuando Mc1r se une a su ligando cognado de alta afinidad, la hormona estimulante de melanocitos α-(α-MSH), hay una activación de la adenilato ciclasa y la producción del segundo mensajero AMPc ^23. La respuesta fisiológica normal de la piel después de la exposición UV incluye la producción epidérmica de α-MSH por los queratinocitos ^24-29. Nosotros y otros la hipótesis de que los queratinocitos derivados de α-MSH se une a Mc1r en melanocitos epidérmicos, iniciando la producción aguas abajo del segundo mensajero AMPc a través de la activación de la adenilato ciclasa ^30. niveles de cAMP controlan muchos aspectos de la diferenciación de los melanocitos, incluidas las vías de supervivencia, la reparación del ADN y la síntesis del pigmento. De señalización Mc1r y AMPc inducen claramente los niveles de enzimas y la producción de pigmento eumelanina. Cuando la señalización Mc1r está intacto y los niveles de cAMP melanocíticos son robustos, la eumelanina se produce y la piel se oscurece. Sin embargo, si la señalización Mc1r es defectuoso yniveles de cAMP citoplasmáticos siguen siendo bajos, la feomelanina se produce en lugar ^{de 1.} Síntesis de eumelanina se puede estimular farmacológicamente por los agentes que elevan los niveles de cAMP ^1,14,31-35.

Dado que la proteína Mc1r es un importante regulador de riesgo de melanoma en humanos ^36-46, estamos interesados ​​en los mecanismos por los cuales Mc1r protege melanocitos contra la carcinogénesis inducida por UV. Como base para nuestros estudios, hemos generado un modelo murino Mc1r variante transgénica en una pura C57BL / 6 antecedentes genéticos ^1. En este modelo, factor de células madre (SCF) se expresa constitutivamente en la epidermis basal y epidérmicas melanocitos interfollicular se retienen en la piel durante toda la vida ^47, en contraste con los ratones no transgénicos en los que los melanocitos se localizan en la dermis en los folículos pilosos. Con el transgén K14-Scf incorporada, la epidermis se vuelve pigmenta con la característica de pigmentos de melanina en particular del pigmentocepa del animal ^1. ratones K14-Scf en el fondo genético C57BL / 6 con el tipo salvaje señalización Mc1r tiene la piel de color negro azabache que se caracteriza por niveles muy altos de pigmento eumelanina. No es sorprendente que estos animales son altamente resistente a rayos UV. En contraste, genéticamente compatibles K14-Scf C57BL / 6 animales que albergan un mutante inactivo Mc1r casi no tienen eumelanina en la epidermis. En cambio, estos animales "extensión" (Mc1r ^{e / e)} tienen una tez de piel blanca causada por el depósito de pigmento feomelanina (Figura 1A) y son mucho más sensibles a la radiación ^UV-48-49.

Compuestos farmacológicos con propiedades químicas que permiten la penetración en la piel han demostrado inducir potentemente eumelanina en la extensión (Mc1r ^{E / E)} modelo animal K14 SCF por la manipulación directa de los niveles de cAMP en los melanocitos epidérmicos en la piel. La regulación positiva de melanina en este modelo ha sido reported por la activación de la adenilato ciclasa ^1, así como la inhibición de la fosfodiesterasa 4 ^35. En este artículo, se demuestra la preparación y aplicación tópica de forskolina en extensión (Mc1r ^{e / e)} animales K14-Scf qué modelo de lo humano-UV sensible de piel clara. Se demuestra que la aplicación dos veces al día del medicamento promueve melanización acelerado, este oscurecimiento de la piel es debido a la deposición epidérmica de pigmento de melanina y que la melanina epidérmica inducida protege contra las quemaduras solares inducidas por UV a través de la medición de la "dosis mínima eritematosa" (MED) ^48.

Protocol

1. Preparación de forskolina para la administración tópica de un extracto de la raíz cruda de la planta Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Los protocolos para experimentos murinos siguen las pautas de conducta ética en el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Kentucky (Protocolo # 00768M2004). El extracto de raíz se compone en peso 40% / volumen en una base dermatológica estándar de etanol al 70%, 30…

Representative Results

C57BL / 6 ratones fueron generados sobre fondos eumelanotic, pheomelanotic o amelanóticos que incorporan el transgén K14 SCF tal como se describe (Figura 1A). Cohortes de extensión de piel clara (Mc1r E / E, + / + Tyr) los ratones se trataron tópicamente con dosis dos veces al día de vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) o 40% de extracto de raíz de Coleus forskohlii crudo (80 micras por dosis) durante 5 días (Figura 2 B). Efectos de los …

Discussion

Usando un modelo animal de la humana de piel clara, nos encontramos con que la aplicación tópica de un extracto de la raíz cruda forskolina ricos oscurece robustamente la epidermis estimulando la producción de melanina en la piel. Melanización epidérmico es dependiente de la expresión de factor de células madre en la epidermis basal, como ocurre en la piel humana pero no en la piel sin modificar genéticamente-ratón. La piel dorsal de los ratones genéticamente-no modificada carece de un número suficiente de m…

Materials

			Reagents
Coleus Forskoli extract 20%	Buckton Scott USA Inc.	n/a	Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP	Butler Schein	NCD 11695-6776-1	Dublin, OH, USA
Xylazine	Anased Injection	LA04612	Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP	Putney	NDC 26637-411-01	St. Joseph, MO, USA
Ethanol	Decon Labs.	2705
Propylene glycol	Adesco	05751L	Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair	Church & Dwight	JF-11 4381322	Priceton, NJ
			EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B	Westinghouse	F15T8UV-B
Radiometer photometer	International light	1LT400A	Peabody, MA,USA
Chromameter	Konica Minolta	CR-400	Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400	Konica Monilta	DR-400	Ramsey, NJ, USA