Un essai de microplaques pour évaluer les effets des produits chimiques sur RBL-2H3 mât dégranulation: Effets de Triclosan sans utilisation d'un solvant organique

Summary

Dégranulation des mastocytes, la libération de médiateurs de l'allergie, est important dans les allergies, l'asthme et la défense parasite. Ici, nous démontrons techniques ¹ pour évaluer les effets des médicaments et des substances toxiques sur la dégranulation, la méthodologie utilisée récemment pour exposer l'effet inhibiteur puissant agent antibactérien triclosan de ^2.

Abstract

Les mastocytes jouent un rôle important dans la maladie allergique et de défense immunitaire contre les parasites. Une fois activé (par exemple, par un allergène), ils dégranulent, un processus qui aboutit à l'exocytose des médiateurs de l'allergie. Modulation de la dégranulation des mastocytes par les drogues et les substances toxiques peuvent avoir des effets positifs ou négatifs sur la santé humaine. Fonction des mastocytes a été disséqué en détail l'utilisation des mastocytes de leucémie basophiles de rat (RBL-2H3), un modèle largement accepté de mastocytes des muqueuses de l'homme ^3-5. Mât composant de cellules granulaires et le médiateur allergique β-hexosaminidase, qui est libéré linéairement parallèlement à l'histamine à partir de mastocytes ^6, peuvent facilement et de façon fiable être mesurées par réaction avec un substrat fluorogène, ce qui donne l'intensité de fluorescence mesurable dans un essai de micro-plaque qui se prête à études à haut débit ^1. Initialement publié par Naal et al. ^1, nous avons adapté ce test de dégranulation pour le dépistage oles médicaments et les substances toxiques F et démontrer son utilité ici.

Le triclosan est un agent antibactérien à large spectre qui est présent dans de nombreux produits de consommation et a été trouvé pour être une aide thérapeutique dans la maladie allergique de la peau humaine ^7-11, bien que le mécanisme de cet effet est inconnue. Ici, nous démontrons une analyse de l'effet du triclosan sur la dégranulation des mastocytes. Nous avons récemment montré que le triclosan affecte fortement la fonction des cellules de mât ^2. Dans un effort pour éviter l'utilisation d'un solvant organique, le triclosan est dissous directement dans un tampon aqueux avec la chaleur et l'agitation, et la concentration résultante est confirmée par spectrophotométrie UV-Vis (avec ε = 4,200 ₂₈₀ L / M / cm) ^12. Ce protocole a le potentiel pour être utilisé avec une variété de produits chimiques afin de déterminer leurs effets sur la dégranulation des mastocytes, et plus largement, leur potentiel allergique.

Introduction

Les mastocytes sont très granulé cellules immunitaires effectrices qui servent de médiateurs clés dans l'asthme, les allergies, parasite de la défense et la carcinogenèse ^13-16. Ils résident dans presque tous les tissus vascularisés ^15, où ils stockent en toute sécurité médiateurs inflammatoires et allergiques dans les granules cytoplasmiques avant d'être activée à dégranuler. Dégranulation est l'exocytose des granules liés à la membrane, ce qui entraîne la libération de médiateurs pharmacologiquement actives telles que l'histamine, la tryptase, et leucotriènes ^15. Ce procédé conduit à l'initiation de type I des réactions d'hypersensibilité qui sont essentiels à la défense de montage contre les parasites ainsi que le lancement des réactions allergiques, asthmatiques, et cancérigène ^15.

Les mastocytes et les basophiles expriment des récepteurs FceRI, les récepteurs de haute affinité pour les immunoglobulines E (IgE) ^17. L'exposition à un allergène ou antigène provoque l'agrégation de multiples récepteurs FceRI IgE liés ^17, et c'est ce so-disant «réticulation» de récepteurs Fc des IgE liés qui déclenche le processus de dégranulation: une cascade d'événements tyrosine phosphorylation, l'activation de la phospholipase C, flux de calcium dans les magasins internes, et l'afflux de calcium dans la cellule ^18. Cet afflux de calcium est nécessaire à la dégranulation, et, en outre, les signaux de fusion des granules avec la membrane avant de provoquer l'exocytose des granules ^15. Expérimentalement, un ionophore du calcium peuvent être utilisés pour faire la navette calcium directement à travers la membrane de la cellule ^19, ce qui évite pratiquement tout transduction du signal étapes avant l'étape de l'influx de calcium ^20, permettant l'identification d'une cible de la voie par un produit toxique comme étant en amont ou en aval de signalisation de calcium ^20.

Dégranulation peut être mesuré rapidement et efficacement en surveillant la libération de β-hexosaminidase dans un surnageant de cellules, qui est libéré à partir des granulés linéairement le long d'histamine ^6, mais is beaucoup plus facile à détecter à l'aide d'une simple réaction enzyme-substrat, et un lecteur de microplaque pour doser le produit fluorescent. Ce dosage en microplaque, tel que décrit dans la section du protocole, est basée sur une méthode robuste développé à l'origine par Naal et al. ^1, qui quantifie le clivage du substrat fluorogénique 4-méthylumbelliféryl-N-acétyl-β-D-glucosaminide par β- hexosaminidase. Nous avons modifié l'analyse des effets des essais de médicaments et de substances toxiques, avec triclosan a mis en évidence ici. Cette méthode quantifie de manière fiable la dégranulation, est une alternative peu coûteuse pour, par exemple, les méthodes de détection par cytométrie en flux offre ^21, et a le potentiel pour se prêter gentiment de criblage à haut débit d'une grande variété de médicaments anti-allergiques, ainsi que immunotoxiques ou de produits chimiques allergènes. Ce dernier point est particulièrement important à la lumière du rapport de 2007 du Conseil national de recherches "Tests de toxicité au ^21ème siècle: une vision et une Stratgie "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 ), qui milite pour le développement de tests de toxicologie à haut débit qui utilisent la culture cellulaire pour réduire l'utilisation coûteuse des animaux de laboratoire traditionnels tels que la souris. Le protocole mis au point par la dégranulation Naal et al. ¹ et modifié par nous ^2, utilise la lignée de cellules RBL-2H3 qui est un modèle bien accepté homologue à mastocytes des muqueuses de l'homme ou des basophiles ^5.3. (Méthodes de culture de cellules RBL-2H3 sont détaillés dans Hutchinson et al. ^22). Ce test pourrait probablement être adapté à tout type de mastocytes ci-joint.

Triclosan (TCS) est un antimicrobien à large spectre qui a été utilisé pendant plus de 30 ans dans les hôpitaux, les produits de soins personnels et des biens de consommation ^23,24. Le mode d'action pour caractéristique antimicrobienne de TCS est l'inhibition de la biosynthèse des acides gras, probablement en inhibant énoyl-acylréductase protéine porteuse ^25,26. Il se trouve dans le monde entier dans une vaste gamme de produits de consommation tels que gel douche, lotion pour les mains, dentifrice, rince-bouche, et savons pour les mains à des concentrations allant jusqu'à 0,3% ou de 10 mm ^24. L'utilisation généralisée du TCS a donné lieu à des niveaux détectables chez l'homme et ^27-29 dans les rivières et les ruisseaux ^30. Une étude réalisée par Allmyr et al. ²⁷ a démontré que TCS et ses métabolites sont présents à la fois dans le plasma et le lait des mères qui allaitent. Surtout, TCS est facilement absorbé par la peau ^31-37. Queckenberg et al. ³⁷ ont trouvé ~ absorption de 10% d'une ~ 70 mM crème TCS dans la peau de l'homme dans les 12 heures, aboutissant à une concentration significative dans la peau, où les mastocytes résident.

TCS a été cliniquement prouvé pour gérer la maladie allergique de la peau humaine ^7-11, mais le mécanisme par lequel TCS soulage les maladies allergiques de la peau a été inconnue ^38. Utilisation de la detaile de dosage en microplaque fluorescentd Dans cette vidéo, nous avons récemment démontré que TCS, à des concentrations aussi faibles que 2 pm, atténue considérablement la fonction des mastocytes et la dégranulation, fournissant une explication possible de ces données cliniques ^2. En plus de fournir une explication à ces données cliniques, nos résultats à Palmer et al. ² suggèrent que TCS vise molécules de signalisation en aval de l'afflux de calcium. En raison de l'importance de la signalisation dans de nombreux immunologique et d'autres processus biologiques calcium, TCS pourrait avoir des effets négatifs sur une grande variété de processus biologiques nécessaires. En fait, Udoji et al. ³⁹ a montré que TCS supprime l'activité des cellules tueuses naturelles humain lytique, une autre fonction immunitaire innée importante.

Au-delà de son potentiel comme une aide thérapeutique dans la maladie allergique de la peau (ou, au contraire, comme un immunotoxique), TCS peut aussi être un perturbateur endocrinien ^40-49. Ainsi, une procédure claire sur la façon de préparer ce produit chimique en solution is d'intérêt pour les toxicologues. Parce que TCS est une petite molécule hydrophobe, les véhicules organiques sont souvent utilisés pour le rendre plus soluble dans l'eau. Dans la plupart des études de toxicité où TCS a été testé, la préparation a impliqué dissolution dans l'eau à l'aide d'un solvant organique tel que l'éthanol, l'acétone, ou de l'huile ^2,50,51. Toutefois, il arrive souvent ces solvants sont biologiquement actifs eux-mêmes, ce qui complique l'interprétation de la substance d'essai données ^51. En fait, selon Rufli et al. ⁵² et ⁵³ autres, il est recommandé que des solutions de test pour les expériences de toxicité aquatique sont préparés en utilisant des méthodes physiques par rapport aux méthodes chimiques, en raison du potentiel de solvants chimiques pour créer des artefacts de toxicité. Nous avons précédemment montré que TCS dissous dans 0,24% éthanol / eau (vol / vol) et traitée aux ultrasons pendant 30 min amortit RBL dégranulation des mastocytes ^2. L'éthanol à des concentrations supérieures à 0,24% a été montré pour freiner la dégradation des mastocytesnulation ^{54,55-exemples} des effets potentiellement confondants de solvants organiques sur les études de toxicité.

Non seulement il est important de considérer l'effet de solvants sur l'organisme ou de cellules utilisées pour l'étude, mais il est aussi important de surveiller l'effet d'un solvant sur le produit chimique d'essai lui-même. Par exemple, Skaare et al. ⁵¹ ont constaté que la dissolution de TCS en polyéthylène glycol (on trouve couramment dans les dentifrices et les rince-bouche) affaibli effets anti-bactériennes et anti-plaque chez les femmes femelles en bonne santé tout en dissolution dans les huiles causé une perte complète de la fonction. Par conséquent, la capacité des différents solvants pour moduler toxiques et de drogues, y compris TCS, les effets doivent être pris en compte dans la conception des essais. L'utilisation des huiles ou des additifs de saveur peut interférer avec les effets de TCS dans divers produits ^50,51.

Dans un effort pour éliminer la nécessité d'utiliser des solvants organiques, nous avons amélioré notre méthode pour dissoudre TCS ² en éliminant l'utilisation d'un sol organiquedéfouler. Dans le présent protocole, on dissout granules TCS directement dans le tampon aqueux à chaleur (≤ 50 ° C), puis vérifiez la concentration de ce stock TCS par spectrophotométrie UV-Vis. Ces améliorations sont possibles parce que TCS est soluble dans l'eau jusqu'à 40 pm ( http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) et a été montré pour résister à la dégradation lorsqu'il est chauffé à 50 ° C ( http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) ^56,57. Nous avons également l'avantage supplémentaire de la spectrophotométrie UV-Vis, comme TCS est également connu pour absorber fortement à 280 nm ⁵⁸ avec un coefficient d'extinction molaire de 4,200 L / mol / cm ^12.

Ce protocole fournit un moyen simple, mais efficace pour dissoudre granules TCS dans un tampon sans l'aide d'un solvant organique, notamment le faible coût et la vérification rapidede la concentration, et décrit un dosage de la microplaque fluorescente puissant pour surveiller les effets chimiques sur la dégranulation des mastocytes.

Protocol

Notez que toutes les recettes tampons sont inclus dans un tableau à la fin du texte du protocole. JOUR 1: 1. Préparation des cellules Planifiez 96 puits schéma d'installation de la plaque, centrage des échantillons d'essai sur le tracé afin d'éviter les effets de bord. Allouer trois répétitions pour chaque TCS concentration testée (± dégranulation stimulant de l'antigène ou ionophore), ainsi que trois exemplaires…

Representative Results

Lorsqu'il est chauffé à 50 ° C pendant 90 min, le spectre d'absorption UV-Vis pour TCS produit une forte courbe lisse entre ~ 260 et 300 nm, avec un pic à 280 nm, comme le montre la figure 1. Spectrophotométrie UV-Vis est donc un outil important qui peut être utilisé pour calculer la concentration, puisque le coefficient d'absorption molaire publié à 280 nm est 4,200 L / mol / cm 12. Nous avons constaté que TCS ne tombe pas de solution au cours de la période de toute l'expérience de d?…

Discussion

En 2004, Naal et al. ¹ développé un biocapteur des mastocytes de test à haut débit de la dégranulation. Il s'agit d'un test robuste que nous avons adapté à nos études TCS et détaillées dans cette vidéo. Avant la Naal et al. ¹ essai, la dégranulation des mastocytes a été évaluée régulièrement par β-hexosaminidase ^59-61, mais ces premières méthodes utilisées fluoromètres dont un échantillon a été lue à la fois. Surtout, Naal et al. concordance direc…

Materials

RBL-2H3 Cells	ATCC	CRL-2256	The cells we used were a gift, but they are also available from ATCC
Triclosan/Irgasan	Sigma	72779 CAS# 3380-34-5	Should be stored in a low humidity environment
Trypsin	Gibco	25300-054 CAS# 3380-34-5
EMEM	Lonza	12-611F
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Gentamycin Sulfate	Lonza Biological Sciences	17-518
Albumin, Bovine Serum	Calbiochem	12659 CAS# 9048-46-8
Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% solution)	Pierce	28314 CAS# 9002-93-1
HEPES	J.T Baker	4153-01 CAS# 75277-39-3
Magnesium Chloride	VWR	BDH0244-500G CAS# 7791-18-6
D-(+)-Glucose	Biomedicals	152527 CAS# 50-99-7
Potassium Chloride Crystal	J.T Baker	3046-01 CAS# 7447-40-7
Calcium chloride dihyrdate	Acros Organics	207780010 CAS# 10035-04-8
Glycine	Sigma	G8898 CAS# 56-40-6
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)	EMD Biosciences	474502-250MG CAS # 37067-30-4	Wrap in foil – is light-sensitive
Anti-DNP Mouse IgE	Sigma	D8406	Reagent has concentration of 1 mg/ml. Aliquot 25 µl of reagent into separate microcentrifuge tubes and Parafilm. Store aliquots at -20 °C that are not being used and store aliquot that is being used at 2-8 °C for no longer than 1 month.
DNP-BSA	Gift from Dr. David Holowka and Dr. Barbara Baird, Cornell University		Suggest: life technologies DNP-BSA catalog# A23018
Calcium Ionophore A23187	Sigma	C75-22-1mg	Ionophore was made from a powder by adding 400 µl of fresh 100% DMSO into the ionophore vial and is kept at -20 °C Note: we have used the ionophore past its 3 month expiration date successfully
DMSO	Sigma	D2650 CAS# 67-68-5
Acetic Acid	VWR	BDH3094-2 CAS# 64-19-7
Anhydrous Sodium Carbonate	Sigma	222321 CAS# 497-19-8
Sodium Chloride	Sigma	71376 CAS# 7647-14-5
Hydrochloric Acid	VWR	BDH3026 CAS# 7647-01-0
Reference Buffer, pH 7	VWR	BDH5046
Reference Buffer, pH 10	VWR	BDH5072
Reference Buffer, pH 4	VWR	BDH5018
pH electrode storage solution	VWR	14002-828
			Equipment:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
DU 7500 Spectrophotometer	Beckmann	No longer sold
Synergy 2 plate reader Uses Gen5 Microplate Data Collection and Analysis Software	BioTek	Module S
Hematocytometer	Hausser Scientific	3110
7 x 7 CER HOT/STIR 120 V Combination hot plate/magnetic stir plate	VWR	97042-634
Centrifuge	Eppendorf	5430
Tissue culture water bath	VWR	Model# 89032-206
Tissue Culture biological safety cabinet SafeGARD (TC hood)	The Baker Company	Model# SG403A-HE
Tissue culture incubator	ThermoScientific	Model# 3598
Pipetman	VWR		Range: P2-P1000
Balance	Mettler Toledo	Model# AG204
pH meter	Symphony/VWR	Model# SB70P
Pipet-Aid	Drummond Scientific	4-000-100
Combitip dispenser	Eppendorf	4981 000.019
			Recipes:
Name	Recipe	Notes
Acetate Buffer, pH 4.4	Make 0.12 M acetic acid and titrate to pH 4.4 with 10 N NaOH. This is 5.3 ml glacial acetic acid into 1 L of MilliQ water: (1 L)*(0.12 mol/L)*(60 g/mol)*(ml/1.37 g) = 5.3 ml because density of glacial is 1.37 g/ml	Sterile Filter into autoclaved glass bottle
Substrate (4-MU)	Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) Store in -20°C Stock: 0.12 M in DMSO (46 mg in 1 ml DMSO), warm to 37 °C, vortex, sonicate 10 min. in water-bath sonicator with warm water, vortex again	For each experiment, make fresh solution of substrate in acetate buffer (100x dilution), for final concentration of 1.2 mM in acetate buffer
Glycine Carbonate Buffer, pH 10	26.7 g glycine 47.1 g anhydrous sodium carbonate Add deionized water for 1 L, and adjust pH to 10	Sterile filter into autoclaved glass bottle
Tyrodes (2 L), pH 7.4	135 mM NaCl: 15.78 g (or 270 ml of 1 M) 5 mM KCl: 10 ml of 1 M stock 1.8 mM CaCl2: 7.20 ml of 0.5 M stock 1 mM MgCl2: 4.00 ml of 0.5 M stock 5.6 mM glucose: 2.02 g (11.2 ml of 1 M) 20 mM HEPES: 40 ml of 1 M stock Using concentrated HCl pH from ~9.7-7.4	Sterile filter into autoclaved glass bottle
RBL Cell Media	Thaw fetal bovine serum (FBS, stored at -20 °C) for about 4 hours in 37 °C water bath Follow standard sterile technique Get out 1 L minimum essential medium (MEM) with L-glutamine (with Earle’s salts) Pour off some MEM to have 800 ml MEM, add 200 mL warm FBS Add 1 ml gentamicin sulfate antibiotic to 1 L of media with sterile pipette Only use media bottles that have been autoclaved and marked for cell culture use only.	Sterile filter (0.2 mm) into autoclaved glass bottle
			Plastic material used:
Material Name	Company	Catalogue Number	Type of Plastic
200 µl Disposable sterile pipet tips with graduations in 96 rack	VWR	53509-009	polypropylene
1,000 µl Sterile aerosol pipet tips with HighRecovery	VWR	89003-420	polyethylene
10 µl micro tip low binding sterile	VWR	14217-704	polypropylene
Disposable/conical Microcentrifuge tubes for high G-force	VWR	20170-038	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 50 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-178	polypropylene
Disposable/graduated/conical/sterile 15 ml centrifuge tubes with screw caps	VWR	21008-103	polypropylene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-25 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	690175	polystyrene
CELLSTAR Tissue Culture Treated T-75 Flask w/ Filter Cap	Greiner Bio One	658175	polystyrene
CELLSTAR 10 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	607180	polystyrene
CELLSTAR 2 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	710180	polystyrene
CELLSTAR 5 ml Paper/Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	606180	polystyrene
CELLSTAR 25 ml Paper /Plastic Wrapped Serological Pipette	Greiner Bio One	760180	polystyrene
1 cm cuvettes	N/A	N/A	polystyrene
CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid 96-well Plate	Greiner Bio One	655086	polystyrene
Combitips	Eppendorf	022266501	Polypropylene/ polyethylene