Ett protokoll för Fag Display och Affinity val med rekombinanta protein Beten
Summary
Fag-display är en kraftfull teknik för att fånga proteiner eller proteinkomponenter som interagerar med en immobiliserad molekyl av intresse. När ett beslut om vilken typ av fag cDNA-bibliotek för att skapa och skärmen har gjorts, det protokoll som beskrivs här tillåter effektiv affinitet val som leder till identifiering av interactmedlemmar.
Abstract
Med användning av rekombinant-fag som en byggnadsställning för att presentera olika proteindelarna som kodas av en riktat klonat cDNA-bibliotek till immobiliserade betes molekyler är ett effektivt sätt att upptäcka interaktioner. Tekniken har i stor utsträckning använts för att upptäcka protein-proteininteraktioner, men betet molekyl att utmanas behöver inte vara begränsad till proteiner. Protokollet presenteras här har optimerats för att möjliggöra ett blygsamt antal beten som ska screenas i replikat för att maximera identifiera oberoende kloner som uppvisar samma protein. Detta tillåter större förtroende för att interagerande proteiner identifieras är legitima interagerande av betet molekylen. Övervakning av fag-titer efter varje affinitet urvalsomgång ger information om hur affinitets valet fortskrider samt om effekten av negativa kontroller. Ett sätt att titrering fag, och hur och vad man ska förbereda sig i god tid för att denna process att utvecklas så effektivt sommöjligt, presenteras. Attribut för amplikoner som hämtas efter isolering av oberoende plack är markerade som kan användas för att fastställa hur väl affinitetsselektion har framskridit. Felsökning tekniker för att minimera falska positiva eller att kringgå envist återhämtat fag förklaras. Medel för att minska viral kontamination blossa upp diskuteras.
Introduction
Varför använda fag-display och affinitet val i stället för de otaliga andra tekniker som finns för att upptäcka och utreda protein interaktioner med andra molekyler? Fag display kan göra anspråk på några unika fördelar jämfört med andra metoder för att detektera protein-ligand interaktioner 1-3 bland annat följande:
Mycket bred repertoar av bete molekyler
Den främsta orsaken är den mångfald av molekyler som kan fungera som bete i affinitetsselektering 4. Faguppvisning är ett mycket kraftfullt medel för isolering av proteinfragment som växelverkar med andra proteiner, nukleotider, kolhydrater, etc. 5 I huvudsak, om en polymer / molekyl kan fästas till ett återhämtningsbart stöd, kan screenas med avseende på affinitet med fag visade proteinerna. Dessutom kan bete molekyl nås för att bestämma om det bibehåller biologisk aktivitet vid immobilisering 6, om villkoren för att rHÄRLEDA / eliminera dess aktivitet är effektiva 6 eller, för att införa post-translationella modifieringar av betet före affinitetsselektion.
Fag motstånd mot yttre faktorer
En andra anledning till att använda fag display, är att det är möjligt att en del beten kan kräva miljöbelastning (värme, höga osmolytiska koncentrationer, specifika kofaktorer, osv.) För att fånga deras interagerande proteiner, eller fag visade proteinerna kan behöva något sätt förändras före affinitetsselektion. Den primära faktorn som studeras är interaktionen mellan bete och protein, inte villkoret som tillåter interaktion förekomma eller om den är letal för testorganismen. T7-fagen är speciellt väl lämpad för sådana studier eftersom det kan motstå hårda experimentella betingelser både intakta och livskraftiga (t.ex. den publicerade termiska maximum för T7 viabilitet är ~ 60 ° C 7). Som ett exempel på förändra fag visade proproteiner, vid prövningen av Arabidopsis thaliana frö proteomen för proteinsubstrat av reparationsenzym, Protein Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), det virus som används i dessa studier hade varit "äldre" i en vecka, före varje affinitet urvalsomgången, för att uppmuntra införande av isoaspartate (isoAsp) rester hos känsliga proteiner 6 vilket inte är möjligt i organismer som kan känna igen och reparera / metabolisera sådana avvikelser.
Metaboliskt inert
Dessutom fag är oftast resistenta mot metabola gifter och störande små molekyler som skulle, åtminstone, resulterar i pleiotropa effekter på metaboliskt aktiva testorganismer. Efter de stringenstvättar är giftet bort innan en stor mängd bakterier införs för infektion så giftet späds till ett intervall oskadliga för bakterier eller efterföljande fag-replikation. Samtidigt undersöker proteinmålen i PIMT reparationenzym, S-adenosylmetionin (AdoMet) användes för att aktivera mikro titer-platt väl immobiliserat enzym för att medge målprotein fånga samtidigt förlita sig på S-adenosyl Homocystein (AdoHcy) för att inaktivera enzymet och ge en användbar negativ kontroll fixera vetskapen om att viruset inte skulle påverkas negativt genom att antingen AdoMet eller AdoHcy 6. Dessutom, medlemmar i vissa Late Embryogenesis Abundant (LEA) proteinfamiljer, som undersöktes i denna laboration, är kända för att förändra sin form i närvaro av tillsatser såsom sackaros 8 att de kan uppnå så höga koncentrationer som 200 mM i sojabönfrön vid punkten fysiologisk mognad 9. Viruset förväntas inte påverkas av tillsats av 200 mM sackaros i varje affinitet urvalsomgång, eventuellt behövs för vissa LEA-client proteininteraktioner, vilket inte är fallet för självständigt livskraftiga testorganismer 10.
Denna labb har fokuserat på discoverinG-protein-proteininteraktioner i mogna, torkade eller groende frön som ligger bakom mekanismen för lagrade proteomet skydd under uttorkning 11 eller reparation av komponenter i den lagrade proteome som är känsliga för isoAsp bildning när fröet har insupit 6. Således, produktion och rening av rekombinanta proteiner som krävs som bete i ett aktivt tillstånd, och se till att de förblir så, före och efter att de är immobiliserade, men ofta svårt, är en av hörnstenarna i vårt arbete. Eftersom varje rekombinant proteinproduktion scenario är olika, optimerar förutsättningarna för rekombinant proteinproduktion kommer inte att behandlas här. Användarna uppmanas att försöka, om möjligt, för att avgöra om det immobiliserade proteinet är fortfarande funktionellt (t.ex. om det är ett enzym, göra en enzymanalys i mikrotiterplattbrunnar). Detta kommer att ge viss tillförsikt att betet är biologiskt aktiva och därför att alla upptäckta interaktionernågot mer benägna att ha biologisk relevans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genom att köra försöket i tre replikerade brunnar, kan självständigt förvärvat fag av samma proteinbindning till betet urskiljas, även om de är samma klon (dvs. ingen skillnad i nukleotidsekvensen för CDS region som har erhållits, men dessa har varit hämtas från oberoende brunnar). I annat fall är det enda sättet att skilja mellan fager som kodar för samma protein som binder till betet, om de är oberoende omvänt transkriberade regioner som skiljer sig i någon del av nukleotidsekvensen.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet har delvis finansierats av en NSF IOS (0849230), Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Seed Grant (2011 till 04.375), och Sir Frederick McMaster Research Fellowship till ABD.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
