بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف
Summary
عرض فج هي تقنية قوية لالتقاط البروتينات أو الأنصاف البروتين الذي يتفاعل مع جزيء يجمد الفائدة. مرة واحدة وقد تم اتخاذ قرار من هذا النوع من مكتبة [كدنا] فج لخلق والشاشة، وبروتوكول الموصوفة هنا يسمح اختيار تقارب كفاءة مما يؤدي إلى تحديد interactors.
Abstract
باستخدام فج المؤتلف كما سقالة لتقديم مختلف أجزاء البروتين المشفرة بواسطة مكتبة [كدنا] المستنسخة إتجاهي إلى جزيئات الطعم يجمد هو وسيلة فعالة لاكتشاف التفاعلات. تم إلى حد كبير استخدام هذه التقنية لاكتشاف البروتين البروتين التفاعلات ولكن الطعم جزيء أن يكون الطعن ليس من الضروري أن يقتصر على البروتينات. وقد تم تحسين بروتوكول المعروضة هنا للسماح لعدد متواضع من الطعم ليتم عرضه في مكررات لتعظيم تحديد استنساخ مستقلة تقديم نفس البروتين. هذا يسمح بمزيد من الثقة التي تتفاعل البروتينات التي تم تحديدها هي interactors المشروعة للجزيء الطعم. رصد عيار فج بعد كل اختيار تقارب يوفر جولة المعلومات حول كيفية اختيار تقارب يسير فضلا عن فعالية الضوابط سلبية. إحدى وسائل titering فج، وكيف وماذا لإعداد مقدما للسماح هذه العملية في التقدم بكفاءة كماممكن، ويرد. ويسلط الضوء على سمات amplicons استرجاع التالية العزلة البلاك المستقلة التي يمكن استخدامها للتأكد من مدى تقدمت اختيار تقارب. وأوضح المتاعب تقنيات للحد من ايجابيات كاذبة أو لتجاوز تعافى بإصرار فج اطلاق النار. وتناقش وسائل للحد من التلوث الفيروسي اشتعال.
Introduction
لماذا استخدام عرض فج واختيار تقارب بدلا من غيرها من التقنيات المتاحة لا تعد ولا تحصى لاكتشاف والتحقيق تفاعلات البروتين مع جزيئات أخرى؟ عرض فج يمكن أن يدعي بعض المزايا الفريدة أكثر من غيرها من أساليب الكشف عن البروتين التفاعلات يجند 1-3 بما في ذلك ما يلي:
ذخيرة واسعة جدا من جزيئات الطعم
السبب قبل كل شيء هو في تنوع الجزيئات قادرة على العمل كطعم في اختيار تقارب 4. عرض فج هو وسيلة قوية جدا لعزل شظايا البروتين الذي يتفاعل مع البروتينات الأخرى، النيوكليوتيدات، والكربوهيدرات، الخ 5 أساسا، إذا يمكن تركيبها بوليمر / جزيء إلى دعم استرداده، فإنه يمكن فحص للتقارب مع فج البروتينات عرضها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الوصول إلى جزيء الطعم لتحديد ما إذا كان يحتفظ النشاط البيولوجي عندما يجمد 6، إذا كانت الظروف المستخدمة لصاستخرج / القضاء على نشاطها فعالة أو 6، وإدخال تعديلات ما بعد متعدية إلى الطعم قبل اختيار تقارب.
المقاومة فج لعوامل خارجية
والسبب الثاني لاستخدام العرض فج، غير أنه من الممكن أن بعض الطعوم قد تتطلب الإجهاد البيئي (الحرارة، وتركيزات عالية osmolyte، العوامل المساعدة محددة، الخ.) لالتقاط البروتينات التفاعل، أو قد تحتاج فج البروتينات عرض لتغييرها بطريقة أو بأخرى قبل اختيار تقارب. العامل الأساسي قيد الدرس هو التفاعل بين الطعم والبروتينات، وليس شرط أن يسمح التفاعل أن يحدث أو إذا كان فتاكة بالنسبة لكائن الاختبار. فج T7 بشكل خاص مناسبة تماما لمثل هذه الدراسات لأنها يمكن أن تحمل الظروف القاسية التجريبية على حد سواء سليمة وقابلة للحياة (على سبيل المثال الحد الأقصى للبقاء الحرارية نشرت T7 هو ~ 60 درجة مئوية 7). كمثال على تغيير فج عرض المواليةالبروتينات، عند دراسة بروتيوم بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana لركائز البروتينية للانزيم إصلاح، بروتين Isoaspartyl الميثيل Transferease (PIMT)، وهو الفيروس المستخدمة في هذه الدراسات كانت "العمر" لمدة أسبوع واحد، وقبل كل اختيار تقارب الجولة، لتشجيع إدخال من isoaspartate (isoAsp) مخلفات في البروتينات عرضة 6 وهو أمر غير ممكن في الكائنات الحية التي يمكن التعرف وإصلاح / استقلاب مثل هذه التشوهات.
خاملة أيضي
وعلاوة على ذلك، فإن فج وعادة ما تكون مقاومة للسموم الأيض والتدخل الجزيئات الصغيرة التي من شأنها، على الأقل، يؤدي إلى آثار عديد المظاهر على الكائنات اختبار عملية الأيض نشطة. بعد يغسل صرامة، تتم إزالة السموم قبل أن يتم إدخال كمية كبيرة من البكتيريا لعدوى حتى يتم تخفيف السم لمجموعة حميدة للبكتيريا أو تكرار فج لاحقة. أثناء التحقيق أهداف البروتين في إصلاح PIMTانزيم، وكان يستخدم S-Adenosyl الميثيونين (AdoMet) لتنشيط انزيم يجمد الدقيقة عيار لوحة جيدا للسماح الهدف التقاط البروتين في حين أن الاعتماد على S-Adenosyl الهموسيستين (AdoHcy) لإبطال نشاط انزيم وتوفير السيطرة السلبية مفيدة في تأمين مع العلم بأن الفيروس لن تتأثر سلبا من قبل أي AdoMet أو AdoHcy 6. بالإضافة إلى ذلك، أعضاء معينة في وقت متأخر مرحلة التطور الجنيني الأسر وفرة (LEA) البروتين، والتحقيق في هذا المختبر، ومن المعروف أن تغيير شكلها في وجود مواد مضافة مثل السكروز 8، والتي يمكن الحصول على تركيزات عالية مثل 200 ملم في بذور فول الصويا عند نقطة من النضج الفسيولوجي 9. ولا يتوقع الفيروس أن تتأثر إضافة 200 ملي السكروز في كل جولة اختيار تقارب، وربما ضرورية لبعض تفاعلات البروتين LEA العميل، الذي ليس هو الحال بالنسبة للكائنات قابلة للحياة مستقلة اختبار 10.
وقد ركز هذا المختبر على discoverinز البروتين البروتين التفاعلات في والبذور المجففة أو الإنبات الناضجة التي تكمن وراء آلية الحماية بروتيوم المخزنة خلال 11 الجفاف أو إصلاح مكونات بروتيوم المخزنة التي هي عرضة للتشكيل isoAsp مرة واحدة وقد تشربوا البذور 6. وبالتالي، فإن إنتاج وتنقية البروتينات المؤتلف المطلوبة كطعم في حالة نشطة، والتأكد من أنها تظل كذلك، قبل وبعد ويجمد أنها، على الرغم من صعوبة في كثير من الأحيان، هو حجر الزاوية في عملنا. لكن، وكما لكل سيناريو إنتاج البروتين المؤتلف هو مختلف، لن تكون موجهة الظروف الأمثل لإنتاج البروتين المؤتلف هنا. وحثت المستخدمين على محاولة، حيثما أمكن، لتحديد ما إذا كان البروتين يجمد لا يزال وظيفية (على سبيل المثال إذا كان هو انزيم، القيام فحص انزيم في الآبار وحة microtiter). هذا وسوف توفر بعض الثقة بأن الطعم هو النشطة بيولوجيا، وبالتالي، أن أي تفاعلات اكتشفت هيإلى حد ما أكثر عرضة لأهميتها البيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عن طريق تشغيل التجربة في ثلاثة آبار منسوخة، فج المكتسبة بشكل مستقل من نفس البروتين ملزمة إلى الطعم يمكن تمييزها حتى لو كانت هي نفسها استنساخ (أي لا فرق في تسلسل النوكليوتيدات المنطقة CDS التي تم الحصول عليها ولكن كانت هذه استردادها من آبار مستقلة). خلاف ذلك، فإن ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع جزئيا من قبل NSF IOS (0849230)؛ هاتش، McIntire-ستينيس (AD421 كريس)، وزارة الزراعة منح البذور (2011-04375)، والسير فريدريك زمالة أبحاث ماكماستر إلى ABD.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
