Un protocole pour Phage Display et Affinity sélection en utilisant appâts protéine recombinante
Summary
La présentation de phage est une technique puissante pour capturer des protéines ou des fragments protéiques qui interagissent avec une molécule d'intérêt immobilisé. Une fois la décision du type de banque d'ADNc de phage pour créer et écran a été fait, le protocole décrit ici permet la sélection d'affinité efficace menant à l'identification des interacteurs.
Abstract
Utilisation de phage recombinant comme un échafaudage pour présenter différentes parties de protéines codées par une bibliothèque d'ADNc cloné de manière directionnelle à des molécules immobilisées d'appât est un moyen efficace pour découvrir des interactions. La technique a été largement utilisée pour découvrir les interactions protéine-protéine, mais la molécule d'appât pour être contestée ne doit pas être limité à des protéines. Le protocole présenté ici a été optimisée pour permettre à un petit nombre d'appâts à cribler dans les répétitions de maximiser l'identification de clones indépendants présentant la même protéine. Cela permet une plus grande confiance que les protéines en interaction sont identifiés interacteurs légitimes de la molécule d'appât. Le suivi du titre de phages après chaque sélection d'affinité fournit des informations sur la façon rond la sélection par affinité progresse ainsi que sur l'efficacité des contrôles négatifs. Un moyen de titrage du phage, et comment et quoi préparer à l'avance pour permettre à ce processus de progresser le plus efficacementpossible, est présenté. Attributs de amplicons récupérées après l'isolement de la plaque indépendant sont mis en évidence qui peut être utilisé pour déterminer la façon dont la sélection d'affinité a progressé. Techniques de tournage pour minimiser les faux positifs ou de contourner la persistance récupéré phage difficulté sont expliqués. Moyens de réduire la contamination virale embrasement sont discutés.
Introduction
Pourquoi utiliser phage display et la sélection d'affinité à la place des autres techniques innombrables disponibles pour découvrir et étudier les interactions des protéines avec d'autres molécules? La présentation de phage peut réclamer des avantages uniques par rapport aux autres méthodes de détection des interactions protéine-ligand 1-3, y compris ce qui suit:
Très vaste répertoire de molécules d'appâts
La première raison est dans la diversité des molécules capables d'agir comme appât dans une sélection par affinité 4. La présentation de phage est un moyen très puissant de l'isolement des fragments de protéines qui interagissent avec d'autres protéines, des nucléotides, des hydrates de carbone, etc 5 Essentiellement, si un polymère / molécule peut être fixé à un support récupérable, elle peut être criblée pour l'affinité avec les protéines affichées de phage. En outre, la molécule d'appât peut être accédé pour déterminer si elle conserve une activité biologique quand elle est immobilisée 6, si les conditions utilisées pour réduire / éliminer son activité sont efficaces ou 6, d'apporter des modifications post-traductionnelles à l'appât avant la sélection d'affinité.
résistance aux phages à des facteurs externes
Une seconde raison pour utiliser la présentation du phage, est qu'il est possible que certains appâts peuvent nécessiter un stress environnemental (chaleur, des concentrations élevées d'osmolyte, cofacteurs spécifiques, etc.) Pour capturer les protéines interagissantes, ou peut-être besoin d'être quelque peu modifié les protéines affichées phagiques avant la sélection d'affinité. Le premier facteur est étudié l'interaction entre la protéine appât et, pas à la condition qui permet l'interaction se produise ou, si elle est létale pour l'organisme d'essai. Le phage T7 est particulièrement bien adapté à de telles études, car il peut résister à des conditions expérimentales difficiles à la fois intact et viables (par exemple le maximum thermique publié pour T7 viabilité est ~ 60 ° C 7). A titre d'exemple de modification phage affiché proprotéines, lors de l'examen du protéome des graines d'Arabidopsis thaliana pour les substrats protéiques de l'enzyme de réparation, protéines isoaspartyl méthyle Transferease (PIMT), le virus utilisé dans ces études avaient été «vieilli» pendant une semaine, avant chaque sélection par affinité ronde, afin d'encourager l'introduction de isoaspartate (isoAsp) résidus dans les protéines sensibles 6 qui n'est pas possible dans les organismes qui peuvent reconnaître et réparer / métaboliser ces anomalies.
Métaboliquement inerte
En outre, le phage sont généralement résistants aux poisons métaboliques et interférant petites molécules qui, au moins, se traduire par des effets pléiotropiques sur les organismes d'essai métaboliquement actives. Après les lavages de stringence, le poison est retirée avant une grande quantité de bactéries, on introduit de l'infection de sorte que le poison est dilué à une gamme inoffensif pour les bactéries ou la réplication du phage ultérieure. Alors qu'il enquêtait sur des cibles de protéines de la réparation de PIMTenzyme, S-adénosyl méthionine (AdoMet) a été utilisé pour activer l'enzyme micro-titre-plaque-bien immobilisé pour permettre protéine capture de cible tout en s'appuyant sur la S-adénosyl homocystéine (AdoHcy) pour inactiver l'enzyme et fournir un contrôle négatif utiles en sécurité dans sachant que le virus ne serait pas influencé négativement par l'une ou AdoMet AdoHcy 6. En outre, les membres de certaines embryogenèse tardive familles abondante (LEA) de protéines, étudiés dans ce laboratoire, sont connus pour modifier leur forme en présence d'additifs tels que le saccharose 8, qui peut atteindre des concentrations aussi élevées que 200 mm de graines de soja au point de maturité physiologique 9. Le virus n'est pas prévu d'être influencé par addition de saccharose 200 mM à chaque tour de sélection d'affinité, peut-être nécessaire pour certaines interactions entre protéines LEA-client, ce qui n'est pas le cas pour les organismes viables autonome d'essai 10.
Ce laboratoire a mis l'accent sur DÉCOUVERTEg interactions protéine-protéine dans les graines en germination ou déshydratés matures qui sous-tendent le mécanisme de protection du protéome stockée pendant la déshydratation 11 ou la réparation des composants du protéome stockée qui sont sensibles à la formation isoAsp une fois que les semences ont bu 6. Ainsi, la production et la purification des protéines recombinantes nécessaires comme appât dans un état actif, et veiller à ce qu'ils le restent, avant et après ils sont immobilisées, bien que souvent difficiles, est une pierre angulaire de notre travail. Cependant, comme chaque scénario de production de protéines recombinantes est différente, les conditions pour l'optimisation de la production de protéines recombinantes ne seront pas abordées ici. Les utilisateurs sont invités à tenter, autant que possible, afin de déterminer si la protéine immobilisée est encore fonctionnel (par exemple, s'il s'agit d'une enzyme, faire une analyse de l'enzyme dans les puits de plaques de microtitration). Cela fournira une certaine confiance que l'appât est biologiquement active et, par conséquent, que les interactions sont découvertspeu plus susceptibles d'avoir une pertinence biologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
En exécutant l'expérience dans trois puits répliqués, phage de la même liaison à l'amorce protéique acquise de façon indépendante peuvent être distingués, même si elles sont du même clone (c'est à dire pas de différence dans la séquence nucléotidique de la région de la CDS qui a été acquise, mais ceux-ci ont été récupéré à partir des puits indépendants). Sinon, le seul moyen de faire la distinction entre un phage codant pour la même liaison à la protéine appât est s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé en partie par un IOS NSF (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Subvention de démarrage (2011-04375), et Sir Frederick McMaster de bourses de recherche de DEA.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
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