Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder
Summary
Phagen-Display ist eine leistungsfähige Technik, Proteine oder Proteineinheiten, die mit einem immobilisierten Molekül von Interesse in Wechselwirkung zu erfassen. Sobald eine Entscheidung über die Art der Phagen-cDNA-Bibliothek zu erstellen und zu Bildschirm gemacht worden ist, das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine effiziente Affinitätsselektion, die zu Identifizierung der Interaktionspartner.
Abstract
Verwendung von rekombinanten Phagen als Gerüst, um verschiedene Proteinabschnitte durch eine richtungs klonierten cDNA-Bibliothek zu immobilisierenden Molekülen codiert Köder präsentieren, ist ein effizientes Mittel, um Wechselwirkungen zu entdecken. Die Technik wurde weitgehend verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu entdecken, sondern der Köder-Molekül in Frage gestellt werden muss nicht auf Proteine beschränkt. Die hier vorgestellten Protokoll optimiert worden, damit eine bescheidene Anzahl von Ködern in Replikaten gescreent werden, um die Identifizierung der unabhängigen Klonen da er das gleiche Protein zu maximieren. Dies ermöglicht eine größere Zuversicht, dass interagierende Proteine identifiziert sind legitime Interaktoren des Köders Molekül. Die Überwachung der Phagen-Titer nach jeder Affinität Auswahlrunde bietet Informationen darüber, wie die Affinitätsselektion voran sowie auf die Wirksamkeit der negativen Kontrollen. Ein Mittel zum Titrieren der Phagen und wie und was zu im Voraus vorzubereiten, damit dieser Prozess so effizient wie Fortschrittemöglich ist, wird dargestellt. Attribute abgerufen Amplikons nach der Isolierung von unabhängigen Plaque werden hervorgehoben, die verwendet werden können, um festzustellen, wie gut die Affinitätsselektion fortgeschritten ist. Fehlerlokalisierungstechniken, Fehlalarme zu minimieren oder zu umgehen anhaltend erholt Phagen werden erläutert. Mittel zur Reduzierung der viralen Kontamination aufflammen werden diskutiert.
Introduction
Warum Phagen-Display-und Affinitätsselektion statt der unzähligen anderen für die Entdeckung und Untersuchung von Protein-Interaktionen mit anderen Molekülen verfügbaren Techniken? Phagen-Display kann einige einzigartige Vorteile gegenüber anderen Verfahren zum Nachweis von Protein-Ligand-Wechselwirkungen 1-3 einschließlich der folgenden aufweist:
Sehr breite Repertoire der Köder Moleküle
Der wichtigste Grund ist in der Vielfalt der Moleküle wirken kann als Köder in Affinitätsselektion 4. Phagendisplay ist ein sehr wirksames Mittel zur Isolierung von Protein-Fragmenten, die mit anderen Proteinen, Nukleotiden, Kohlenhydrate, etc. 5. Wesentlichen interagieren, wenn ein Polymer / Molekül kann an einen Träger gebunden erzielbaren werden kann, kann zur Affinitäts mit Phagen-Proteine gescreent werden. Zusätzlich kann das Köder-Molekül zugegriffen, um festzustellen, ob es die biologische Aktivität beibehält, wenn sie immobilisiert 6 werden, wenn die Bedingungen verwendet werden, um reduce / eliminieren seine Tätigkeit wirksam sind 6 oder, post-translationale Modifikationen auf den Köder vor der Affinitätsselektion einzuführen.
Phage Widerstand gegen äußere Faktoren
Ein zweiter Grund für die Verwendung von Phagen-Display, ist, dass es möglich ist, dass einige Köder erfordern Umweltstress (Hitze, hohe Konzentrationen Osmolyten, spezifischen Kofaktoren, usw..), Um ihre wechselwirkende Proteine zu erfassen, oder die Phagen-Proteine müssen irgendwie verändert werden vor der Affinitätsselektion. Der primäre Faktor untersucht, ist die Wechselwirkung zwischen Köder und Protein, nicht die Bedingung, dass die Wechselwirkung auftreten können oder wenn es tödlich für den Testorganismus. Die T7-Phagen ist besonders gut geeignet für solche Studien, da es hart experimentellen Bedingungen sowohl intakt und lebensfähig zu widerstehen (z. B. die veröffentlichte thermische Maximum für T7 Lebensfähigkeit ~ 60 ° C 7). Als ein Beispiel des Änderns Phagen proProteine, bei der Prüfung der Arabidopsis thaliana Samen für Proteom-Proteinsubstraten der Reparatur-Enzym, Protein Isoaspartyl Methyl Transferase (PIMT), das Virus in diesen Studien verwendet hatte "gealtert" war für eine Woche vor jeder Affinität Auswahlrunde, um die Einführung zu fördern von isoaspartate (isoAsp) Reste bei empfindlichen Proteine 6, die in Organismen, die erkennen und reparieren / verstoffwechseln solche Anomalien nicht möglich ist.
Metabolisch inert
Weiterhin werden die Phagen in der Regel resistent gegen Stoffwechselgiften und störende kleine Moleküle, die, zumindest, führen würde pleiotrope Wirkungen auf metabolisch aktive Testorganismen. Nach den Waschungen Stringenz wird das Gift, bevor eine große Menge von Bakterien zur Infektion eingeführt, das Gift ist auf einen Bereich um die Bakterien harmlos oder nachfolgenden Phagenreplikations verdünnt entfernt. Bei der Untersuchung der Protein-Targets PIMT ReparaturEnzym, S-Adenosylmethionin (AdoMet) wurde verwendet, um die Mikro-Titer-Platten-und immobilisierte Enzym zu aktivieren, um Zielprotein Abfangen zu ermöglichen, während sich auf S-Adenosyl Homocystein (AdoHcy) zur Inaktivierung des Enzyms und bieten eine nützliche Negativkontrolle sichern in das Wissen, dass das Virus nicht durch beider AdoMet oder AdoHcy 6 beeinflusst werden. Zusätzlich Mitglieder bestimmter spätEmbryoGenese Reichlich (LEA) Proteinfamilien, in diesem Labor untersucht, sind dafür bekannt, ihre Form in Gegenwart von Zusätzen wie Sucrose 8, die hohen Konzentrationen von 200 mM in Sojabohnensamen an dem Punkt erreichen kann, zu verändern physiologischer Reife 9. Das Virus wird nicht angenommen, dass durch Zugabe von 200 mM Saccharose in jeder Runde der Affinitätsselektion, möglicherweise für bestimmte LEA-Client-Protein-Wechselwirkungen erforderlich, was nicht der Fall autonom lebensfähigen Testorganismen 10 beeinflusst werden.
Dieses Labor hat sich auf ENTDECKEN konzentriertG-Protein-Protein-Wechselwirkungen in reifen, dehydriert oder keimenden Samen, die den Mechanismus der gespeicherten Proteom Schutz während der Dehydratisierung 11 oder Reparatur von Komponenten des gespeicherten Proteom, die anfällig für isoAsp Bildung sind, wenn das Saatgut aufgesaugt 6 zugrunde liegen. Somit ist die Produktion und Aufreinigung der rekombinanten Proteine als Köder in einem aktiven Zustand erforderlich ist, und sicherzustellen, dass sie so bleiben, bevor und nachdem sie immobilisiert werden, obwohl häufig schwierig ist, ist ein Grundpfeiler unserer Arbeit. Doch wie jedes rekombinante Proteinproduktion Szenario ist anders, die Optimierung der Bedingungen für die Produktion rekombinanter Proteine wird hier nicht angesprochen werden. Die Benutzer werden aufgefordert, zu versuchen, wo immer möglich, zu bestimmen, ob das immobilisierte Protein noch funktionsfähig ist (z. B. wenn es ein Enzym, tun ein Enzym-Assay in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten). Dies wird etwas Vertrauen, dass der Köder ist biologisch aktiv und daher, dass alle entdeckten Wechselwirkungenetwas häufiger auf biologische Relevanz haben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indem das Experiment in drei replizierten Vertiefungen, kann einzeln erfasst Phagen des gleichen Proteins, das an dem Köder zu unterscheiden, selbst wenn sie die gleichen Klon (dh kein Unterschied in der Nukleotidsequenz der CDS-Region, die erfasst worden ist, aber diese haben sich von unabhängigen Brunnen abgerufen). Ansonsten ist der einzige Weg, um unter den gleichen Phagen-Protein-Bindung an den Köder kodiert, zu unterscheiden, ob sie unabhängig voneinander revers transkribiert Regionen, die in einem Te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Seed Grant (2011 bis 04375) und Sir Frederick McMaster-Forschungsstipendium, um ABD; Dieses Projekt wurde teilweise durch einen NSF IOS (0849230) gefördert.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
