Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante
Summary
Phage display è una tecnica potente per catturare proteine o porzioni di proteine che interagiscono con una molecola immobilizzata di interesse. Una volta presa una decisione del tipo di libreria di cDNA fagi per creare e lo schermo, il protocollo qui descritto consente la selezione affinità efficiente che porta alla identificazione di interattori.
Abstract
Utilizzando fago ricombinante come impalcatura per presentare varie porzioni di proteine codificate da una libreria di cDNA clonato direzionalmente a molecole esca immobilizzate è un mezzo efficace per scoprire le interazioni. La tecnica è stata ampiamente utilizzata per individuare le interazioni proteina-proteina, ma la molecola esca per essere messo in discussione non deve essere limitata alle proteine. Il protocollo qui presentato è stato ottimizzato per consentire un modesto numero di esche da sottoporre a screening in replicati per massimizzare l'identificazione di cloni indipendenti che presentano la stessa proteina. Ciò consente una maggiore fiducia che le proteine che interagiscono individuate sono interattori legittimi della molecola esca. Monitoraggio del titolo fago dopo ogni selezione affinità fornisce rotonda informazioni sulla selezione di affinità sta procedendo nonché sull'efficacia dei controlli negativi. Uno dei mezzi per la titolazione del fago, e come e cosa preparare in anticipo per consentire a questo processo di progredire nel modo più efficientepossibile, è presentato. Attributi di ampliconi recuperati previo isolamento della placca indipendente sono evidenziate che può essere utilizzata per determinare quanto bene la selezione di affinità è progredita. Difficoltà tecniche per ridurre al minimo i falsi positivi o per aggirare persistente recuperare fago riprese sono spiegato. Mezzi di ridurre la contaminazione virale divampare sono discussi.
Introduction
Perché usare phage display e la selezione affinità invece della miriade di altre tecniche disponibili per la scoperta e lo studio delle interazioni proteina con altre molecole? Phage display può vantare alcuni vantaggi unici rispetto ad altri metodi di rilevazione di interazioni proteina-ligando 1-3, tra cui i seguenti:
Molto ampio repertorio di molecole esca
Il motivo principale è nella diversità delle molecole in grado di agire come esca nella selezione affinità 4. Phage display è un potente mezzo di isolare frammenti di proteine che interagiscono con altre proteine, nucleotidi, carboidrati, ecc 5 In sostanza, se un polimero / molecola può essere attaccato ad un supporto recuperabile, può essere schermato per affinità con le proteine fagiche visualizzati. Inoltre, la molecola esca può accedere per determinare se esso mantiene l'attività biologica quando immobilizzato 6, se le condizioni usati per reduce / eliminare la sua attività sono efficaci o 6, per introdurre modificazioni post-traslazionali per l'esca prima selezione affinità.
Fago resistenza a fattori esterni
Una seconda ragione per usare phage display, è che è possibile che alcune esche possono richiedere stress ambientale (calore, elevate concentrazioni osmolyte, cofattori specifici, etc.) Per catturare le proteine interagenti, o le proteine indicate nel fago può essere necessario qualche modo alterato prima della selezione di affinità. Il fattore primario di essere studiati rappresenta l'interazione tra esca e proteine, non la condizione che consente l'interazione si verifichi o se non è letale per l'organismo di prova. Il fago T7 è particolarmente adatto per tali studi perché può sopportare condizioni sperimentali difficili sia intatto e vitali (ad esempio il massimo termico pubblicato per vitalità T7 è ~ 60 ° C 7). Come esempio di alterazione fago visualizzata proproteine, nell'esaminare il proteoma seme Arabidopsis thaliana per substrati proteici del enzima di riparazione, Proteina Isoaspartyl metile Transferease (PIMT), il virus utilizzato in questi studi era stato "invecchiato" per una settimana, prima di ogni selezione affinità turno, per favorire l'introduzione di isoaspartate (isoAsp) residui di proteine sensibili 6 che non è possibile negli organismi in grado di riconoscere e riparare / metabolizzare tali anomalie.
Metabolicamente inerte
Inoltre, il fago sono solitamente resistenti ai veleni metabolici e interferire piccole molecole che, almeno, provocare effetti pleiotropici sugli organismi di prova metabolicamente attive. Seguendo i lavaggi di stringenza, il veleno viene rimosso prima che una grande quantità di batteri vengono introdotti per infezione così il veleno viene diluita ad una gamma innocuo per i batteri o successiva replica fago. Mentre indaga bersagli proteici della riparazione PIMTenzima, S-adenosil metionina (AdoMet) è stato utilizzato per attivare l'enzima micro-titolo-piastra-ben immobilizzato per consentire di cattura della proteina bersaglio mentre si basa su S-adenosil omocisteina (AdoHcy) per inattivare l'enzima e fornire un controllo negativo utile fissare in la consapevolezza che il virus non essere negativamente influenzata da una AdoMet o AdoHcy 6. Inoltre, membri di alcune famiglie embriogenesi Dopo abbondante (LEA) proteine indagate in questo laboratorio, sono noti per alterare la loro forma in presenza di additivi come saccarosio 8, che possono raggiungere concentrazioni fino a 200 mm di semi di soia al punto di maturità fisiologica 9. Il virus non è previsto per essere influenzato da aggiunta di saccarosio di 200 mm in ogni round di selezione per affinità, forse necessario per alcune interazioni proteina LEA-client, che non è il caso per gli organismi di prova autonomamente vitali 10.
Questo laboratorio si è concentrata sulla discovering interazioni proteina-proteina in maturi, i semi disidratati o germinazione che sono alla base del meccanismo di protezione proteoma immagazzinata durante la disidratazione 11 o la riparazione dei componenti del proteoma memorizzata che sono sensibili alla formazione isoAsp una volta che il seme ha assorbito 6. Così, la produzione e purificazione di proteine ricombinanti richiesti come esca in uno stato attivo, e garantendo che rimangano così, prima e dopo che sono immobilizzati, anche se spesso difficile, è un elemento fondamentale per il nostro lavoro. Tuttavia, come ogni scenario di produzione di proteine ricombinanti è diversa, le condizioni di ottimizzazione per la produzione di proteine ricombinanti non verranno affrontati qui. Gli utenti sono invitati a tentare, ove possibile, per determinare se la proteina immobilizzata è ancora funzionante (ad esempio se si tratta di un enzima, fare un test enzimatico nei pozzetti di micropiastre). Questo fornirà una certa sicurezza che l'esca è biologicamente attivo e, pertanto, che eventuali interazioni scoperti sonoalquanto più probabilità di avere rilevanza biologica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eseguendo l'esperimento in tre pozzi replicate, fago acquisito indipendentemente vincolante all'esca stessa proteina può essere distinto anche se sono lo stesso clone (cioè nessuna differenza nella sequenza nucleotidica della regione CDS che è stata acquisita ma questi sono stati recuperati dai pozzi indipendenti). Altrimenti, l'unico modo per distinguere tra fago codifica vincolante per l'esca stessa proteina è se sono indipendentemente invertire regioni trascritte che differiscono in qualc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato parzialmente finanziato da un NSF IOS (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA di Grant Seed (2.011-04.375), e Sir Frederick McMaster Research Fellowship a ABD.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
