En protokoll for Fag Display og Affinitetsutvelgelse Bruke rekombinante protein agn

Summary

Phage skjermen er en kraftfull teknikk for å fange proteiner eller proteinmolekyldeler som virker sammen med et immobilisert molekyl av interesse. Når en beslutning om hva slags fag cDNA bibliotek for å opprette og skjermen har blitt gjort, protokollen beskrevet her tillater effektiv affinitet valg som fører til identifisering av interactors.

Abstract

Ved hjelp av rekombinant fag som et stillas for å presentere ulike protein deler kodet av en retnings klonet cDNA bibliotek til immobilisert agn molekyler er et effektivt middel for å oppdage interaksjoner. Teknikken har i stor grad blitt brukt for å oppdage protein-protein interaksjoner, men agnet molekylet for å bli utfordret trenger ikke være begrenset til proteiner. Protokollen presenteres her har blitt optimalisert for å tillate et beskjedent antall agn for å bli vist i replikater å maksimere identifisering av uavhengige kloner presentere det samme proteinet. Dette tillater større tillit til at samspill proteiner identifisert er legitime interactors av agn molekylet. Overvåking av fag-titeret etter hver affinitet valg gir året informasjon om hvordan affinitet valg utvikler seg, så vel som på effekten av negative kontroller. Et virkemiddel titering fagen, og hvordan og hva de skal forberede seg på forhånd for å tillate denne prosessen for å komme videre så effektivt sommulig, er presentert. Attributter av amplicons hentet følgende isolering av uavhengige plakk er markert som kan brukes til å fastslå hvor godt affinitet utvalget har kommet. Feilsøking teknikker for å minimere falske positive eller å omgå vedvarende utvinnes fag er forklart. Virkemiddel for å redusere viruskontaminasjon blusse opp er diskutert.

Introduction

Hvorfor bruke fag-skjerm og affinitet utvalg i stedet for de utallige andre teknikker for å oppdage og etterforske protein interaksjoner med andre molekyler? Phage skjerm kan kreve noen unike fordeler fremfor andre fremgangsmåter for påvisning av protein-ligand interaksjoner ^1-3 inkludert følgende:

Svært bredt repertoar av agn molekyler

Den fremste årsaken er i mangfoldet av molekyler som kan opptre som agn i affinitet utvalg ^fire. Phage Display er en meget kraftig middel til å isolere proteinfragmenter som interagerer med andre proteiner, nukleotider, karbohydrater, etc. ⁵ I hovedsak, dersom en polymer / molekyl kan være festet til en gjenvinnbar støtte, kan det bli screenet for affiniteten med phage viste proteiner. I tillegg kan agnet molekyl er tilgjengelig for å bestemme om den beholder biologisk aktivitet når de immobilisert ^6, hvis betingelsene som brukes til å reduce / eliminere dens aktivitet er effektive ^{til 6,} eller for å innføre post-translasjonelle modifikasjoner til agnet før affinitet markering.

Fag motstand mot utenforliggende faktorer

En annen grunn for å bruke fag-display, er at det er mulig at noen agn krever miljøstress (varme, høy osmolyte konsentrasjoner, spesifikke kofaktorer, etc.) For å fange opp de interagerende proteiner, eller fagen viste proteiner kan trenge å bli noe forandret før affinitet utvalg. Den primære faktor som studeres er samspillet mellom agn og protein, ikke den tilstand som tillater interaksjon forekommer, eller hvis det er dødelig for testorganismen. Den T7 phage er spesielt godt egnet til slike studier fordi det kan tåle tøffe eksperimentelle betingelser både intakte og levedyktig (for eksempel den publiserte termo maksimum for T7 levedyktighet er ~ 60 ° C ^7). Som et eksempel på en endring phage viste proproteiner, når undersøke Arabidopsis thaliana frø proteomet for protein substrater for reparasjonen enzymet, Protein Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), viruset som brukes i disse studiene hadde vært "gammel" i en uke, før hver affinitet utvalg runde, for å oppmuntre til innføring av isoaspartate (isoAsp) tørket i mottakelige proteiner ^seks som ikke er mulig i organismer som kan gjenkjenne og reparasjon / forbrenne slike misdannelser.

Metabolsk inert

Videre fagen er vanligvis motstandsdyktige mot metabolske giftstoff og forstyrrer små molekyler som kan, i det minste resultere i mitogen effekt på metabolsk aktive testorganismer. Etter stringens vaskinger, er giften fjernes før et stort volum av bakterier er innført for infeksjon slik at giften fortynnes til et område uskadelige for bakterier eller påfølgende fag-replikasjon. Mens undersøke protein mål av PIMT reparasjonenzym, ble S-adenosylmetionin (AdoMet) som brukes til å aktivere mikro titer-plate-brønn immobilisert enzym for å tillate målprotein fangst samtidig avhengig av S-adenosylhomocystein (AdoHcy) for å inaktivere enzymet, og gir en nyttig negativ kontroll fiksere vissheten om at viruset ikke ville bli negativt påvirket av enten AdoMet eller AdoHcy ^seks. I tillegg er visse medlemmer av sen embryogenese Rikelig (LEA) proteinfamilier, som er undersøkt i dette laboratoriet, er kjent for å endre sin form, i nærvær av additiver, slik som sakkarose ^8, som kan oppnå konsentrasjoner så høye som 200 mM i soyabønne frø ved punktet av fysiologisk modenhet ^ni. Viruset er ikke forventet å være påvirket ved tilsetning av 200 mM sukrose i hver affinitet valg runde, eventuelt nødvendig for visse LEA-client protein interaksjoner, som ikke er tilfelle for autonomt levedyktige testorganismer ^10.

Dette laboratoriet har fokusert på discovering protein-protein interaksjoner i modne, dehydrerte eller spirende frø som ligger til grunn for mekanismen av lagret proteom beskyttelse under dehydrering ¹¹ eller reparasjon av komponenter av den lagrede proteomet som er utsatt for isoAsp formasjon når frøet har imbibed ^seks. Dermed produksjon og rensing av rekombinante proteiner som kreves som agn i en aktiv stat, og å sikre at de forblir slik, før og etter at de er immobilisert, men ofte vanskelig, er en hjørnestein i vårt arbeid. Men som hver rekombinant protein produksjon scenario er forskjellig, optimalisere forholdene for rekombinant protein produksjonen vil ikke bli behandlet her. Brukere oppfordres til å forsøke, der det er mulig, for å avgjøre om det immobiliserte protein er fortsatt funksjonell (for eksempel hvis det er et enzym, gjør et enzym assay i mikrotitreringsplate brønnene). Dette vil gi en viss tillit til at agnet er biologisk aktive og derfor at enhver oppdaget interaksjoner ernoe mer tilbøyelige til å ha biologisk relevans.

Protocol

En grafisk fremstilling av fremgangsmåten beskrevet nedenfor (fig. 1) fremhever de to primære komponenter for affinitet valg ved hjelp av et fag display-bibliotek: A) et fag display-bibliotek cDNA sannsynlig å koder proteiner med affinitet for agnet, og, b) et renset rekombinant agn protein. Produksjon av agn (rekombinant protein) har blitt grundig undersøkt og litteratur som beskriver beste praksis for å sikre løselig, aktiv rekombinant protein fra E. coli 12-13, eukaryote gj?…

Representative Results

Å være i stand til å nedsette evnen av agnet til å interagere med phage-tall proteiner (metabolsk forgiftning agnet) er et potent negativ kontroll for denne teknikken. Det er også tilrådelig å fastslå om agnet, når bundet til mikrotiter-plate-brønn, beholder sin funksjon. Begge disse kontrollene vil øke tilliten som samhandlende, fagplakker-vises proteiner utvinnes av nonpoisoned agn er legitime. Prøvetaking tre triplicates fra hver brønn legger vesentlig til tid og arbeid invol…

Discussion

Ved å kjøre forsøket i tre replikerte brønner, kan uavhengig ervervet phage av samme proteinbinding til agn skilles selv om de er de samme klon (dvs. ingen forskjell i nukleotid-sekvensen til det CDS region som er blitt ervervet, men disse har vært hentes fra uavhengige brønner). Hvis ikke, er den eneste måte å skille blant fag som koder for den samme proteinbinding til agn hvis de uavhengig er omvendt transkriberte regioner som er forskjellige på en eller annen del av nukleotid-sekvensen.

<p class…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Becton Dickinson Co.	211705
Yeast Extract	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Blocking Reagent	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-212
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
ampicillin, Sodium Salt	Research Products International	A40040
ethidium bromide	Fisher Scientific	BP102-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
penta-HIS primary antibody	Qiagen Inc.	34660
Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP primer	EMD Chemicals Inc.		5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′
T7-DOWN primer	EMD Chemicals Inc.		5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Gel Extraction kit	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Invitrogen Life Technologies	4336917
Heating Block	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96 Well Cell Culture Plates	Corning	Costar 3590
Isotemp Incubator Oven	Fisher Scientific	516D
Pasteur Pipets, 5 ¾”	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Gloves, Nitrile	Fisher Scientific	19-170-010C
Sterile 1.5 ml tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
10 ml borosilicate Pipets	Fisher Scientific	13-678-25E
Borosilicate culture tubes	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, ELISA plate reader	Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland	Type 362