Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante
Summary
A exibição em fagos é uma técnica poderosa para captura de proteínas ou fracções de proteínas que interagem com uma molécula de interesse imobilizada. Uma vez tomada uma decisão sobre o tipo de biblioteca de cDNA de fagos para criar e tela, o protocolo descrito aqui permite a seleção de afinidade eficiente levando à identificação de interagentes.
Abstract
Usando fago recombinante como um andaime para apresentar várias porções de proteínas codificadas por uma biblioteca de cDNA direcionalmente clonado para moléculas imobilizadas isca é um meio eficiente para descobrir interações. A técnica tem sido largamente usado para detectar interacções proteína-proteína, mas a molécula do isco a ser desafiados não precisa ser restrito a proteínas. O protocolo aqui apresentado foi optimizada para permitir que um pequeno número de iscos para ser exibido em repetições para maximizar a identificação de clones independentes que apresentam a mesma proteína. Isto permite uma maior confiança de que as proteínas que interagem identificados são interagentes legítimos da molécula isca. Monitorando a título de fagos depois de cada selecção de afinidade rodada fornece informações sobre a forma como a selecção por afinidade está progredindo, bem como sobre a eficácia dos controlos negativos. Um meio de titulação do fago, e como eo que se preparar com antecedência para permitir que este processo avance de forma tão eficiente comopossível, é apresentada. Atributos de amplicões obtidos após isolamento de placas independentes são destacadas que pode ser utilizado para determinar quão bem a selecção de afinidade progrediu. Problemas técnicas para minimizar falsos positivos ou de contornar persistentemente recuperado fago tiro são explicados. Meios de reduzir a contaminação viral surto são discutidos.
Introduction
Por que usar de apresentação de fagos e seleção de afinidade em vez de uma miríade de outras técnicas disponíveis para descobrir e investigar as interações de proteínas com outras moléculas? Phage display pode reivindicar algumas vantagens únicas em relação a outros métodos de detecção de interações proteína-ligante 1-3 incluindo o seguinte:
Muito amplo repertório de moléculas de isca
A principal razão é na diversidade de moléculas capazes de actuar como isco na selecção por afinidade 4. A exibição em fagos é um meio muito poderoso para isolar fragmentos de proteínas que interagem com outras proteínas, hidratos de carbono, nucleótidos, etc 5 Essencialmente, se um polímero / molécula pode ser ligada a um suporte recuperável, que podem ser rastreados para afinidade com as proteínas apresentadas em fagos. Além disso, a molécula de isca pode ser acedido para determinar se ele retém a actividade biológica quando imobilizada 6, se as condições usadas para reduce / eliminar a sua actividade são eficazes ou 6, para introduzir as modificações pós-tradução para o isco antes da selecção de afinidade.
Resistência aos fagos a fatores externos
Uma segunda razão para a utilização de apresentação de fagos, é que é possível que alguns iscos pode exigir esforço ambiental (calor, altas concentrações de agente osmótico, co-factores específicos, etc.) Para capturar as proteínas que interagem com, ou as proteínas apresentadas em fagos pode necessitar ser de alguma forma alterados antes da selecção de afinidade. O factor principal a ser estudado é a interacção entre o isco e proteína, não a condição que permite a interacção ocorrer, ou se é letal para o organismo de teste. O fago T7 é particularmente bem adequada para estes estudos porque pode suportar condições experimentais agressivos tanto intacta e viável (por exemplo, o máximo térmico publicado para a viabilidade de T7 é ~ 60 ° C 7). Como um exemplo de alteração fago exibido próproteínas, ao analisar o proteoma semente Arabidopsis thaliana para substratos de proteínas da enzima de reparação, Proteína Isoaspartyl Metil Transferease (PIMT), o vírus utilizado nestes estudos foi "idade", durante uma semana, antes de cada seleção afinidade rodada, para incentivar a introdução de isoaspartate (isoAsp) resíduos de proteínas suscetíveis 6 que não é possível em organismos que podem reconhecer e reparar / metabolizam essas anormalidades.
Metabolicamente inerte
Além disso, os fagos são geralmente resistentes aos venenos metabólicos e interferindo pequenas moléculas que, no mínimo, resultar em efeitos pleiotrópicos sobre organismos de teste metabolicamente activas. Após as lavagens de rigor, o veneno é removido antes de uma grande quantidade de bactérias são introduzidos por infecção de modo que o veneno é diluída a uma gama inócuo para a bactéria ou a replicação do fago subsequente. Ao investigar alvos da proteína do reparo PIMTenzima, de S-adenosil-metionina (AdoMet) foi usado para activar a enzima de micro-titulação de placa-bem imobilizada para permitir a captura de proteína alvo, baseando-se S-adenosil-homocisteína (AdoHcy) para inactivar a enzima e proporcionar um controlo negativo útil fixar em do conhecimento que o vírus não seria influenciada negativamente por qualquer AdoMet ou AdoHcy 6. Além disso, os membros de certas famílias Abundante embriogénese tardia (LEA), proteína investigados neste laboratório, são conhecidos para alterar a sua forma, na presença de aditivos tais como sacarose, 8, que podem atingir concentrações tão elevadas como 200 mM em sementes de soja, no ponto de maturidade fisiológica 9. O vírus não está prevista para ser influenciado pela adição de 200 mM de sacarose em cada fase de selecção de afinidade, possivelmente necessário para certas interações proteína LEA-cliente, o que não é o caso de organismos de teste de forma autônoma viáveis 10.
Este laboratório tem se concentrado em DESCOBERTAg interações proteína-proteína em, sementes desidratadas ou germinando maduros que fundamentam o mecanismo de proteção proteoma armazenadas durante 11 desidratação ou reparação de componentes do proteoma armazenado que são suscetíveis à formação isoAsp uma vez que a semente tem absorvido 6. Assim, a produção e purificação de proteínas recombinantes exigidos como isca em um estado ativo, e garantir que eles permaneçam assim, antes e depois de serem imobilizados, embora freqüentemente difícil, é um dos pilares para o nosso trabalho. No entanto, como cada um dos cenários de produção de proteína recombinante é diferente, as condições para a optimização da produção de proteína recombinante não será abordada aqui. Os utilizadores são convidados a tentar, sempre que possível, para determinar se a proteína imobilizada é funcional (por exemplo, se se trata de uma enzima, fazer um ensaio de enzima nos poços da placa de microtitulação). Isto irá fornecer alguma confiança de que a isca é biologicamente ativo e, portanto, que todas as interações são descobertosum pouco mais propensos a ter relevância biológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao executar o experimento em três poços replicados, fago adquirida independentemente de a mesma ligação com a proteína de isca pode ser distinguida, mesmo se eles são o mesmo clone (isto é, não houve diferença na sequência de nucleótidos da região de CDS que foi adquirido, mas estes têm sido recuperado a partir de poços independentes). Caso contrário, a única maneira de diferenciar entre o fago que codifica para a mesma ligação com a proteína isco é, se eles são independentemente inverter r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi parcialmente financiado por um IOS NSF (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Grant Seed (2011-04375), e Sir Frederick McMaster Bolsa de Investigação para ABD.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
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