Метод В естественных изображений отличить острого и хронического воспаления
Summary
Мы описываем неинвазивного метода визуализации для различения воспалительных стадиях. Системной доставки люминолом показывает областях острого воспаления зависит от активности МПО в нейтрофилах. В противоположность этому, инъекция люцигенином позволяет выводить хронического воспаления зависит от Phox активность макрофагов.
Abstract
Воспаление является фундаментальным аспектом многих заболеваний человека. В этом видео отчет, мы демонстрируем неинвазивных методов визуализации биолюминесценции, которые отличают острого и хронического воспаления в мышиных моделях. С повреждением ткани или патогена вторжения, нейтрофилы являются первой линией обороны, играют важную роль в посредничестве острой воспалительной реакции. Как воспалительная реакция прогрессирует, циркулирующих моноцитов постепенно мигрируют в место повреждения и дифференцироваться в зрелые макрофаги, являющиеся посредниками хроническое воспаление и способствовать восстановлению тканей, удаляя ткани мусора и производство противовоспалительных цитокинов. Внутрибрюшинной инъекции люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион, натриевой соли) позволяет обнаруживать острого воспаления в значительной степени опосредованы ткани проникновения нейтрофилов. Люминол специфически реагирует с супероксид генерируется в фагосомами нейтрофилов с биолюминесценции результаты миелопероксидазы (МPO) опосредованной реакции. Люцигенином (бис-N-methylacridinium нитрат) также вступает в реакцию с супероксид для того, чтобы генерировать биолюминесценции. Тем не менее, люцигенин биолюминесценции не зависит от МПО и это исключительно зависит от фагоцитарной NADPH оксидазы (Phox) в макрофагах при хроническом воспалении. Вместе люминол и люцигенином позволяет неинвазивной визуализации и продольный оценки различных популяций на фагоцитарную как острых, так и хронических воспалительных фаз. С учетом важной роли воспаления в различных заболеваний человека, мы считаем, что это неинвазивный метод визуализации может помочь исследовать дифференциальные роли нейтрофилов и макрофагов в различных патологических состояниях.
Introduction
Воспаление является строго регулируется биологической реакции участвуют в различных заболеваний человека, в том числе микробной инфекции 1, заживление ран 2, диабет 3, 4 рак, сердечно-сосудистые 5, 6 нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваний 7. Воспаление тканей требует надлежащей координации различных иммунных клеток в целях достижения возбудителя оформление, восстановления тканей, и болезнь разрешение. Нейтрофилы и макрофаги являются ключевыми медиаторами иммунного воспаления тканей. В острой фазе воспаления, нейтрофилы первыми отвечают различным вредным воздействиям и повреждение тканей 8. Нейтрофилов быстро вытекать из сосудов в ткань из обращения в месте повреждения, где клетки инактивировать вторжения микробов путем освобождения антимикробные гранул и фагоцитоза. Во фагоцитоз, нейтрофилы поглотить вторжения микробов в фагосомами, в течение которой клетки продуцируют высокие уровни СуперОксIDE (O 2 · -). Phagosomal супероксид является основным источником многих вниз по течению активных форм кислорода (АФК). Например, супероксид может быть dismutated в перекись водорода (H 2 O 2) спонтанное дисмутация или супероксиддисмутаза (SOD), 9, 10. В нейтрофилы, миелопероксидазы (MPO) дальнейшее преобразует перекиси водорода к антимикробным хлорноватистой кислоты (HOCl) 11. Как воспалительные реакции продолжаются, циркулирующих моноцитов постепенно мигрируют в место повреждения и дифференцироваться в зрелые макрофаги 2, чья фагоцитарной функции помогают удалить инактивированных патогенных микроорганизмов и клеточных обломков. Кроме того, в качестве ключевого регулятора в поздней фазе воспаления, макрофагов способствует восстановлению тканей, производя противовоспалительных цитокинов и 12, генерируя внеклеточный ROS на более низком уровне 9. АФК образуются в этой поздней стадии регулируют ремоделирования ткани, образование новых кровеносных и reepitheliaлизации 13.
НАДФН-оксидазы фагоцитов (Phox) является основным источником супероксида в обоих нейтрофилов и макрофагов 9. Phox является мульти-субъединицы комплекса, сборка жестко регулируется 9. Холоферментом содержит несколько цитозольные регуляторных субъединиц (P67 Phox, Phox p47, p40 Phox и RAC) и связанный с мембраной гетеродимером цитохрома Ь 558 (состоит из субъединицы CYBA и CYBB). Цитохром б 558 является реакция ядро, в которой субъединицы CYBB (также известный как p91 Phox и NOX2) осуществляет первичный окислительно-восстановительной реакции цепи 9. Интересно, что свои сайты сборки отличаются между нейтрофилов и макрофагов. В состоянии покоя нейтрофилы, цитохрома Ь 558, в основном, присутствующего в мембране внутриклеточных гранул хранения 14. В процессе фагоцитоза, нейтрофилы собрать чoloenzymes в фагосомами 9, где высокий уровень активности МПО также присутствуют. Нейтрофилов Phox быстро потребляет кислород и оказывает свое бактерицидное власти продукции АФК, явление называется респираторный взрыв 11. Напротив, макрофаги, имеют более низкий уровень экспрессии и MPO цитохрома б 558 встречается в основном в плазматической мембране 15, 16. Таким образом нейтрофилы продуцируют высокие уровни супероксид на антимикробную активность, в то время как макрофаги вырабатывают меньше супероксид для регулирующих функций 15.
Поскольку воспаление является сложной в процессе естественных условиях, неинвазивные методы визуализации специфичны для разных фаз воспаления позволит количественных и продольной оценки модели заболеваний. Использование механистических исследований, ранее мы показали, использование двух хемилюминесцентного вещества, люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион) и люцигенином (бис-N-methylacridinium нитрат), Для неинвазивной визуализации острых и поздних (хронических) стадиях воспаления, соответственно 17. Люминол позволяет визуализировать нейтрофилов активности МПО в острой фазе воспаления 18-20, в то время как люцигенин биолюминесценции может быть использован для оценки активности макрофагов в связи с поздней стадии хронического воспаления или 17. В этой рукописи, мы использовали два экспериментальных моделей воспаления (PMA SC и SC LPS), чтобы продемонстрировать эти методы визуализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом докладе мы демонстрируем биолюминесценции метод неинвазивной визуализации воспаления в живых животных. Преимущества двух люминесцентные субстраты, люминол и люцигенином, способ может различать различные фазы воспаления. Люминол биолюминесценции связан с нейтрофилов в остро?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Нэнси Лурье Marks Foundation. Мы благодарим доктора Нэнси Е. Коль за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим К. Кин Вонг за помощь в подготовке этого видео отчет.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
References
- Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).
- Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
- Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
- Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease–a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
- Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
- Harlan, J. M. Leukocyte-endothelial interactions. Blood. 65, 513-525 (1985).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
- Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
- Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
- Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
- Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
- Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
- Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
- Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
- Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
- Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
- Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
- Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
- Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
- Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
- Dahlgren, C., Karlsson, A. Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).
- Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
- Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).
