I den här artikeln beskriver vi hela experimentella förfarande för att rekonstruera, med hög upplösning, den fina hjärnans anatomi fluorescerande mushjärnorna. Den beskrivna protokollet omfattar provberedning och clearing, exemplar montering för avbildning, uppgifter efterbearbetning och flerskalig visualisering.
Att förstå arkitekturen i däggdjurshjärnan vid encelliga upplösning är en av de viktigaste frågorna i neurovetenskap. Men kartläggning neuronal soma och prognoser i hela hjärnan är fortfarande utmanande för bild-och datahantering teknik. Faktum är makroskopiska volymer måste rekonstrueras med hög upplösning och kontrast i en rimlig tid, som producerar datamängder i TeraByte område. Vi visade nyligen en optisk metod (konfokala ljus ark mikroskopi CLSM) med förmåga att erhålla micron skala rekonstruktion av hela mushjärnor märkta med förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP). Kombinera ljus plåt belysning och konfokal upptäckt, gör CLSM djup avbildning inuti makroskopiska clearade prover med hög kontrast och hastighet. Här beskriver vi den kompletta experimentell pipeline att få heltäckande och mänskliga läsbara bilder av hela mushjärnor märkta med fluorescerande proteiner. Avräkning och monterings pÖRFARANDEN beskrivs, tillsammans med åtgärder för att utföra en optisk tomografi på hela sin volym genom att förvärva flera parallella intilliggande staplar. Vi visade användningen av öppen källkod skräddarsydda programverktyg som möjliggör sömnad av flera stackar och multi-upplösning uppgifter navigering. Slutligen, illustrerade vi några exempel på hjärnkartor: lillhjärnan från en L7-GFP transgen mus, där alla Purkinje celler selektivt märkta, och hela hjärnan från en thy1-GFP-M mus, som kännetecknas av en slumpmässig gles neuronal märkning.
Jämfört med vår förståelse av den molekylära och cellulära mekanismer bakom hjärnans funktion, vår kunskap om fina neuroanatomi ser fortfarande i sin linda 1. I själva verket saknas fortfarande heltäckande kartor över läget för neuronal somata eller långsiktiga prognoser i hela hjärnan. Egentligen är många tekniska ansträngningar åt att rekonstruera musen hjärnan med mikroskopisk upplösning. Optiska metoder baserade på seriesnittning av harts inbäddade prover, som knivsegg Scanning Mikroskopi (KESM) 2, Micro-Optical Sektione Tomography (MOST) 3 och fluorescens-MOST (fMOST) 4, kan ge submikrona tredimensionell upplösning avbildning av hela mushjärnor. Emellertid är den totala tid som krävs för framställning och avbildning av ett enda prov i storleksordningen av flera veckor, vilket begränsar den praktiska tillämpningen av sådana metoder. En annan teknik som bygger på seriesnittning (men utan harts inbäddning), Serial Two-Photon tomografi (STP) 5, tillåter hög tredimensionell upplösning. Emellertid har denna teknik visat i hela mushjärnor endast med en mycket gles provtagning, insamling av ett avsnitt varje 50 | am 5 samt vår kunskap STP ännu inte har producerat en full-sampling rekonstruktion av en murin hjärna.
En avancerad optisk metod för att rekonstruera hela exemplar i tre dimensioner med hög hastighet är lätt blad mikroskopi 6. I detta optiska system provet belyses med ett tunt ark av ljus och fluorescensemissionen uppsamlas längs en axel som är vinkelrät mot belysningsplanet. På detta sätt endast i-fokus fluoroforer är glada och det är möjligt att uppnå en optisk sektionering i fältkonfiguration bred, som garanterar hög bildhastighet. När kopplat till clearing protokoll som bygger på ersättning av vatten med ett brytningsindex matchning vätska 7, har ljus ark mikroskop tillämpats påmakroskopiska prover, som hela mushjärnor 8. Men provet-inducerad ljusspridning, som påverkar ens clearade exemplar, försämrar ljus arket leder till excitation av out-of-fokus fluoroforer som tillför en övergripande oskärpa till de förvärvade bilderna.
För att selektivt samla in endast i-fokus fotoner, vi nyligen kopplat ljus plåt belysning till en konfokala detektionssystemet 9. I konfokal ljus ark mikroskop (CLSM), out-of-fokus och spridda fotoner avslås av en linjär rymdfilter (springa) före detektering (figur 1). För att uppnå konfokal operation i ljus ark arkitektur, är belysning medelst en avsökningslinje, och en de-avsökningssystem i detekteringsvägen skapar en statisk bild av exciteringsavsökningslinjen vid läget för slitsen. Ett tredje skanningssystem rekonstruerar en tvådimensionell bild på kamerans sensor. CLSM ger en 100% kontrastförbättring i rensas mushjärnor i förhållande till konventionell ljusblad mikroskopi, samtidigt som en 10 Hz bildfrekvens. Med CLSM är det möjligt att rekonstruera hela mushjärnor med upplösning på 2 | im i XY och 9 ^ m i Z, och med tillräcklig kontrast för att urskilja enstaka fluorescensmärkta neuroner.
I denna artikel beskriver vi den experimentella pipeline att rekonstruera en mus hjärna med CLSM. Aldehydetrar fast mushjärnorna är uttorkad i en graderad serie av peroxid-fri tetrahydrofuran och därefter godkännas i peroxidfri dibensyleter (figur 2), efter det protokoll som utvecklats av Becker et al. 10 rensas provet sedan försiktigt monterad på en tippat platta och placerad i avbildning kammare av en skräddarsydd konfokala ljus ark mikroskop. Provet kan monteras direkt vid plunging den på en spets av plattan (figur 3a), alternativt kan det limmas på en skiva av rensas agarosgel (Figur3b) eller placeras i hålrummet i en bägare tillverkad av rensas agarosgel (Figur 3c). En optisk tomografi av hela hjärnan utförs sedan, så många parallella intilliggande staplar förvärvas för att täcka alla de hjärnvolym (Figur 4). En pre-tomografi sampling, som ger en grov karta över provets position och form, garanterar att bildbehandling utförs endast i den volym som upptas av provet. De tomografi stackar därefter sys ihop med skräddarsydd programvara och sparas i en multi-upplösning hierarkiskt system 11. Mus hjärnor så småningom kan utforskas med prototypal multi upplösning Google Maps-liknande visualiseringsprogram. Båda dessa mjukvaruinstrument är integrerade som insticksprogram i open-source plattform Vaa3D 12.
Vi visar äntligen representativa bilder av mus hjärnor att undersöka möjligheterna med den beskrivna experimentella pipeline studera fin mus neuroanatomy.
CLSM i kombination med kemisk clearing utgör ett kraftfullt verktyg för att studera neuroanatomi av hela mushjärnor märkta med fluorescerande prober, antingen proteiner eller syntetiska färgämnen. Eftersom det utsända ljuset utanför fokalplanet är blockerad av en fysisk rumslig filter är hög kontrast bildbehandling möjlig även i tjocka prover, samtidigt som den höga bildhastighet som är typiska för lätta plåt arkitektur.
Den viktigaste frågan att ta itu med när man använder de beskrivna metoderna är att maximera kontrasten. I själva verket är den tillgängliga signalen minskas både genom kemiska och optiska faktorer. Ur kemisk synpunkt kan clearingförfaranden baserade på organiska lösningsmedel släcka utsläpp från fluorescerande proteiner och andra fluorescerande färgämnen 7. Filtrering av lösningsmedlet för avlägsnande av peroxider, såsom beskrivs av Becker et al. 10 medger upprätthållande av en god nivå av fluorescens även i lösningsmedels rensas vävnader. Published vattenbaserade clearingmetoder 14 inte minskar fluorescens effektivitet, utan att leda till sämre insyn när det handlar om hela murina hjärnor, åtminstone med linjära optiska tekniker.
Å andra sidan, just nu finns det inga kommersiella mål med långa arbetsavstånd korrigerade för högt brytningsindex (n ≈ 1,56) rensa lösningar som används. Sålunda refraktionsindexet obalans mellan det medium i vilket provet är nedsänkt och designen en av målet ger upphov till starka sfäriska avvikelser. Förutom att minska upplösningen av mikroskop, sådana avvikelser resulterar i en minskning av bildintensitet och kontrast, eftersom ljuset sprids på ett större område. Möjliga lösningar till detta problem inkluderar användning av adaptiv optik 15 och / eller statiska asfäriska correctors.
Varje förbättring i bild kontrast och intensitet drabbar lätt även utskriftshastighet, eftersom en kortareintegrationstiden per bild kan väljas. Just nu CLSM råd med en utskriftshastighet på ca 10 6 ìm 3 / sek, med en kamera exponeringstid på 100 ms 9. Vid denna hastighet tar det 1-3 dagar till bilden en hel mus hjärna, beroende på provstorlek. Även om ingen betydande försämring av bildkvaliteten observeras under så lång avbildning session, främst på grund av den inneboende låg fotoblekning av ljus plåt belysning 6, den långa tid som krävs för att bilden en enda mus hjärna kunde i praktiken minskar tillämpningen av CLSM. En ökning av 10-faldigt i systemeffektivitet, tillsammans med användning av en höghastighetskamera för detektering, skulle reducera avbildningstiden till flera timmar, vilket gör att en rutinmässig användning av det beskrivna protokollet.
Trots alla ovan nämnda begränsningar, CLSM avbildning kopplad till kemisk röjning av vävnader tillstånd att rekonstruera hela mushjärnor med micron skala upplösning på mindre än enveckan. Andra optiska metoder för hela hjärnröntgen råd med högre upplösning än CLSM, men till priset av längre förberedelser och / eller bildbehandling tid 2-4, eller av en gles z provtagning 5.
De metoder som beskrivs i den här artikeln kan användas i kombination med olika strategier för fluorescerande märkning: transgena djur som uttrycker fluorescerande proteiner i utvalda neuronala delmängder, viral transfektion, intraparenkymal färgämne injektion etc. I praktiken alla färgningsstrategier före djuroffer är kompatibla med CLSM . I själva verket har obduktions fluorescerande märkning av hela mushjärnor inte visats hittills, i alla fall, om en sådan typ av färgning skulle vara möjligt inom en snar framtid, hur många exemplar som kunde rekonstrueras med CLSM kommer att bli mycket större, inklusive möjlig mänsklig hjärnvävnad.
Sammanfattningsvis konfokala ljus ark mikroskopi används i kombination med tissue clearing och multi-upplösning datahantering kan tillåta forskare att rekonstruera och analysera makroskopiska prover med upplösning i micron skala, med tekniska insatser som är bra i handen för de flesta laboratorier. Potentiella tillämpningar av CLSM är naturligtvis inte begränsad till neurovetenskap, utan spänner över alla forskningsfält där ljuset blad mikroskopi har redan använts, som embryogenes 16,17 och anatomi smådjur 18.
The authors have nothing to disclose.
Den forskning som lett fram till dessa resultat har erhållit finansiering från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr. 228334 och 241526. Detta forskningsprojekt har också stöd av Human Frontier Science Program forskningsanslag (RGP0027/2009), och av det italienska ministeriet för utbildning, universitet och forskning inom ramen för flaggskeppsprojekt Nanomax och italienska hälsoministeriet inom ramen för den "Stamceller Call for proposals". Denna forskning har genomförts inom ramen för forskningsverksamhet ICON stiftelse som stöds av "Ente Cassa di Risparmio di Firenze".
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |