Facial Transplantaties in<em> Xenopus laevis</em> Embryo's
Summary
Een techniek voor het transplanteren "Extreme Voorste Domain" tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.
Abstract
Craniofaciale aangeboren afwijkingen voorkomen bij 1 op de 700 levendgeborenen, maar etiologie is zelden bekend vanwege de beperkte kennis van craniofaciale ontwikkeling. Om te bepalen waar signaalwegen en weefsels handelen tijdens patroonvorming van de zich ontwikkelende gezicht, heeft een 'gezicht transplantatie-techniek is ontwikkeld in embryo's van de kikker Xenopus laevis. Een gebied van vermoedelijke tissues (de "Extreme Anterior Domain" (EAD)) wordt verwijderd uit een donor embryo in tailbud stadium en getransplanteerd naar een gastheer embryo van dezelfde fase, waarvan de equivalente gebied is verwijderd. Dit kan worden gebruikt om een chimeer gezicht waarbij de gastheer of donor weefsel heeft een verlies of winst van functie in een gen en / of omvat een geslacht label genereren. Na genezing is het resultaat van ontwikkeling gevolgd, en geeft aan rollen van de signalerende weg binnen de donor of de omliggende weefsels van de gastheer. Xenopus is een waardevol model voor gezicht ontwikkeling, zoals het gezicht regio is groot en gemakkelijk eenccessible voor micromanipulatie. Veel embryo's kunnen worden getest, gedurende een korte periode sinds de ontwikkeling snel optreedt. Bevindingen in de kikker zijn aan de menselijke ontwikkeling relevant, aangezien craniofaciale processen lijken geconserveerd tussen Xenopus en zoogdieren.
Introduction
Naar onderliggende mechanismen van craniofaciale aangeboren afwijkingen 1-2, belangrijke weefsels en hun signalering bijdragen tijdens craniofaciale ontwikkeling te begrijpen moeten worden geïdentificeerd. In de kikker Xenopus laevis, een deel van het gezicht, zoals de mond en neus vorm van de "Extreme Anterior Domain" (EAD), waarbij ectoderm en endoderm direct naast elkaar 3-4. De EAD fungeert ook als een signalering centrum omliggende weefsels, waaronder de craniale neurale lijst, die de kaken en andere gezichtgebied 5 vormt beïnvloeden. Om genen die bijdragen aan EAD functie te identificeren, werd een 'gezicht transplantatie-techniek ontwikkeld, waarbij weefsel wordt getransplanteerd van een donor in een gastheer embryo, na het verwijderen van de bijbehorende host-regio. Na de transplantatie, resulterende gezicht ontwikkeling wordt beoordeeld. Aldus worden de effecten van functieverlies (LOF) of overexpressie-(GOF) voor een specifiek gen in de EAD lokaal geanalyseerd waar de rest van de hEAD en lichaam is samengesteld uit wild-type weefsel. De wederzijdse transplantatie kan worden uitgevoerd, waarbij wild-type weefsel wordt getransplanteerd in embryo's met wereldwijde LOF of GOF in specifieke genen. Transplantatie is vaak gebruikt in Xenopus en chick bestudeert 6. Zo heeft Xenopus transplantatie gericht homogenetic neurale inductie, lens en neurale competentie, en de neurale lijst migratie 7-10. Kwartel-chick chimere enten heeft de ontwikkeling van de voorste neurale plaat, voorste neurale kam, neurale en schedelbeenderen 11-14 geanalyseerd. Dit is de eerste transplantatie techniek voor onderzoek van craniofaciale ontwikkeling in Xenopus. Deze techniek heeft een nieuwe rol voor de Wnt-remmers Frzb1 en Crescent in het reguleren van de basale membraan vorming in de vermoedelijke mond 5 aangetoond. Xenopus laevis is een ideaal model voor de studie van craniofaciale ontwikkeling als embryo's zijn groot, ontwikkelen extern, eennd het gezicht is goed zichtbaar, waardoor micromanipulatie en beeldvorming van ontwikkeling. Onderliggende mechanismen gezichtsontwikkeling verschijnen geconserveerd, wat aangeeft dat de bevindingen in de kikker geven inzicht in de menselijke ontwikkeling 4,15-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen en beperkingen: De EAD gezicht transplantatie procedure is tijd en arbeidsintensief. Het vereist oefening, een vaste hand, en behendigheid te perfectioneren. Het gezicht transplantatie protocol is gebaseerd op het vermogen van de onderzoeker om efficiënt te verwijderen en de transplantatie weefsel. Als men te lang duurt om de transplantatie te voegen in het gezicht van de gastheer, zal de gastheer gezicht beginnen te contracteren en te genezen. Tang kan worden gebruikt om delicaat breiden het g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Radek Sindelka voor zijn hulp, en Cas Bresilla voor het assisteren met kikker veeteelt en embryo voorbereiding. Dit werk werd gefinancierd door de NIH via de subsidie R01DE021109 om HLS Laura Jacox werd gefinancierd door de Herschel Smith Graduate Fellowship aan de Harvard University en een F30 individuele beurs subsidie F30DE022989-01 via de NIDCR.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. . Syndromes of the head and neck. , (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. . 발생학. , (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. , (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
