Trapianti viso a<em> Xenopus laevis</em> Embrioni
Summary
Una tecnica per il trapianto "Extreme anteriore dominio" dei tessuti del viso tra Xenopus laevis embrioni è stato sviluppato. Tessuto può essere spostato da un gene espressione sfondo in un'altra, permettendo lo studio delle esigenze locali di sviluppo craniofacciale e di segnalazione interazioni tra regioni facciali.
Abstract
Malformazioni congenite craniofacciali si verificano in 1 su ogni 700 nati vivi, ma l'eziologia è raramente noto a causa della limitata comprensione dello sviluppo cranio-facciale. Per identificare dove percorsi e tessuti segnalazione agiscono durante patterning del viso sviluppo, una tecnica 'trapianto di faccia' è stato sviluppato in embrioni di rana Xenopus laevis. Una regione di presuntiva tessuto facciale (il "Extreme anteriore Domain" (EAD)) viene rimosso da un embrione donatore in fase tailbud, e trapiantato in un embrione ospite della stessa fase, di cui la regione equivalente è stato rimosso. Questo può essere usato per generare una faccia chimerico in cui il tessuto ospite o donatore ha una perdita o guadagno di funzione in un gene, e / o include un'etichetta lignaggio. Dopo la guarigione, il risultato dello sviluppo è monitorato, e indica ruoli della via di segnalazione all'interno del donatore o circostanti tessuti dell'ospite. Xenopus è un modello valido per lo sviluppo viso, come la regione facciale è grande e facilmente unaccessible per micromanipolazione. Molti embrioni possono essere analizzati, nel corso di un breve periodo di tempo dal momento che lo sviluppo avviene rapidamente. I risultati nella rana sono rilevanti per lo sviluppo umano, dal momento che i processi cranio-facciali appaiono conservati tra Xenopus e mammiferi.
Introduction
Per comprendere i meccanismi alla base difetti cranio-facciali congenite 1-2, tessuti importanti e il loro contributo di segnalazione durante lo sviluppo craniofacciale deve essere identificato. Nella rana Xenopus laevis, parte del viso, compresa la bocca e la forma narici dal "Extreme anteriore Domain" (EAD), dove ectoderma e l'endoderma sono direttamente giustapposti 3-4. L'EAD funge anche da centro di segnalazione di influenzare i tessuti circostanti, tra cui la cresta neurale cranica, che forma le mascelle e altre regioni facciali 5. Per identificare i geni che contribuiscono alla funzione EAD, una tecnica di 'trapianto di faccia' è stato sviluppato, in cui il tessuto viene trapiantato da un donatore in un embrione di accoglienza, dopo aver rimosso la regione ospitante corrispondente. Seguendo il trapianto, con conseguente sviluppo facciale viene valutata. Pertanto, gli effetti della perdita di funzione (OL) o guadagno di funzione (GOF) per un gene specifico nell'EAD sono analizzati localmente, dove il resto della head e il corpo è composto di tipo selvatico tessuto. Il trapianto di reciprocità può essere effettuato, se di tipo selvatico tessuto viene trapiantato in embrioni con LOF globale o GOF in geni specifici. Il trapianto è stato frequentemente utilizzato in Xenopus e pulcino studi 6. Ad esempio, Xenopus trapianto ha affrontato induzione homogenetic neurale, obiettivo e competenza neurale, e neural crest migrazione 7-10. Quaglia-chick innesto chimerico ha analizzato lo sviluppo della piastra anteriore neurale, anteriore cresta neurale, cresta neurale, e le ossa craniche 11-14. Questa è la prima tecnica di trapianto per lo studio dello sviluppo craniofacciale in Xenopus. Questa tecnica ha dimostrato un nuovo ruolo per gli inibitori di Wnt Frzb1 e della Mezzaluna nella regolazione della formazione di membrana basale in bocca presuntiva 5. Xenopus laevis è un modello ideale per lo studio dello sviluppo cranio-facciale come embrioni sono grandi, sviluppare esternamente, unnd il volto è facilmente visibile, permettendo micromanipolazione e di imaging di sviluppo. Meccanismi sottostanti lo sviluppo del viso appaiono conservati, indicando che accertamenti effettuati nella rana forniscono informazioni in sviluppo umano 4,15-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fasi critiche e limitazioni: La procedura di trapianto di faccia EAD è il tempo e il lavoro intenso. Si richiede pratica, mano ferma, e la destrezza di perfezionare. Il protocollo di trapianto di faccia si basa sulla capacità del ricercatore di rimuovere in modo efficiente e il tessuto di trapianto. Se si prende troppo tempo per inserire il trapianto nel volto del padrone di casa, il volto ospite inizierà a contrarsi e guarire. Pinze possono essere utilizzati per espandere delicatamente la regione facciale. Tu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Radek Šindelka per il suo aiuto, e Cas Bresilla per aiutare con la rana allevamento e preparazione embrione. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH tramite il R01DE021109 concessione di HLS Laura Jacox è stato finanziato dalla Herschel Smith Graduate Fellowship presso la Harvard University e una borsa F30 borsa individuale F30DE022989-01 attraverso il NIDCR.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
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