Ansikts transplantasjoner i<em> Xenopus laevis</em> Embryo

Summary

En teknikk for å transplantere "Extreme Anterior Domain" ansikts vev mellom Xenopus laevis embryoer har blitt utviklet. Vev kan flyttes fra en genekspresjon bakgrunn inn i en annen, slik at undersøkelse av lokale krav til kraniofacial utvikling og for signalisering interaksjoner mellom ansikts regioner.

Abstract

Kraniofaciale misdannelser oppstår hos 1 av hver 700 levendefødte, men etiologi er sjelden kjent på grunn av begrenset forståelse av kraniofaciale utvikling. For å identifisere hvor signalveier og vev opptre under fordelingen av utviklings ansiktet, har en "ansiktstransplantasjon" teknikken er utviklet i embryoer fra frosken Xenopus laevis. En region av presumptive ansiktsservietter (det "Extreme Anterior Domain" (EAD)) blir fjernet fra en donor embryo ved tailbud stadium, og transplanteres til en verts embryo av samme fase, hvorfra det tilsvarende region er blitt fjernet. Dette kan brukes til å generere et kimært ansikt der verten eller donorvev har en tap eller vinning av funksjon i et gen, og / eller omfatter en avstamning etikett. Etter at helbredelse er resultatet av utviklingen overvåkes, og indikerer rollene til signalveien inne i donor-eller liggende vertsvevet. Xenopus er et verdifullt modell for ansikts utvikling, idet ansikts-området er stort og lett enccessible for micromanipulation. Mange embryoer kan analyseres i løpet av en kort tidsperiode, siden utviklingen skjer raskt. Funn i frosken er relevant for menneskelig utvikling, siden kraniofaciale prosesser vises konservert mellom Xenopus og pattedyr.

Introduction

For å forstå mekanismene bak kraniofaciale misdannelser ^1-2, viktige vev og deres signal bidrag under kraniofaciale utvikling må identifiseres. I frosken Xenopus laevis, en del av ansiktet, inkludert munn og nesebor skjema fra "Extreme Anterior Domain" (EAD), hvor ektoderm og endoderm er direkte sammenstilt ^3-4. Den EAD fungerer også som et signalsenter å påvirke omkringliggende vev, inkludert kranie neural crest, som danner kjevene og andre ansikts regioner ^fem. For å identifisere genene som bidrar til EAD funksjon, ble et "ansikt transplantasjon" teknikken utviklet, hvor vevet er transplantert fra en donor til en verts embryo, etter fjerning av de tilsvarende verts region. Etter transplantasjon, fører ansikts utvikling vurderes. Således er effekten av tap av funksjon (LOF) eller gevinst av funksjon (GOF) for et bestemt gen i EAD analysert lokalt, der resten av head og kropp er sammensatt av villtype vev. Den gjensidige transplantasjon kan utføres, hvor vill type vev er transplantert inn embryoer med global LOF eller GOF i bestemte gener. Transplantasjon har blitt hyppig brukt i Xenopus og dama studerer ^seks. For eksempel har Xenopus transplantasjon adressert homogenetic nevrale induksjon, linse og nevrale kompetanse, og neural crest migrasjon ^7-10. Vaktel-chick kimert pode har analysert utviklingen av fremre nevrale plate, anterior neural rygg, neural crest, og kraniebein ^11-14. Dette er den første transplantasjon teknikk for studier av kraniofaciale utvikling i Xenopus. Denne teknikken har vist en roman rolle for Wnt hemmere Frzb1 og Crescent i å regulere basalmembran formasjonen i presumptive munnen ^fem. Xenopus laevis er en ideell modell for studier av kraniofaciale utvikling som embryoer er store, utvikle eksternt, ennd ansiktet er lett synlig, slik at micromanipulation og avbildning av utvikling. Mekanismene bak ansikts utvikling vises bevart, noe som indikerer at funn som er gjort i frosken gi innsikt i menneskelig utvikling ^4,15-16.

Protocol

En. Forbereder Reagenser 10x MBS: Forbered en L av 10x Modified Barth Saline (MBS) løsning 17. Se Tabell 1, reagenser, ingredienser og instruksjoner. Bruk destillert vann for alle løsninger. Bland i et begerglass under anvendelse av en rørestav, inntil fullstendig oppløsning. Alle løsningene bør bli gjort ved romtemperatur. 1x MBS: Fortynn 100 ml 10x MBS-løsning i 900 ml destillert vann for å lage en L av 1x MBS. Til 0,7 ml med 1 M CaCl 2 løsning. </li…

Representative Results

Transplantert vev skal settes helt inn i vertshodet etter transplantasjon, som vist i figur 3A, og har en glass-broen hensiktsmessig plassert på embryo ansikt, som vist i figur 2BC. Den transplanterte donorvevet må være riktig dimensjonert for verten åpning, for transplantasjon for å være vellykket. Den EAD vevet bør ikke stikker ut fra hodet, i en hvilken som helst måte, som vist i figurene 3B og 3C. I tillegg bør ansikt transplantasjon ikke r…

Discussion

Kritiske trinn og begrensninger: Den EAD ansikt transplantasjon prosedyren er tid og arbeidsintensivt. Det krever øvelse, stødige hender, og fingerferdighet å perfeksjonere. Ansiktet transplantasjon protokollen er avhengig av forskerens evne til effektivt å fjerne og transplantasjon vev. Hvis man tar for lang tid å sette transplantasjon inn i vertens ansikt, vil verts ansiktet begynner å trekke seg sammen og helbrede. Tang kan brukes til å delikat utvide ansiktsregionen. Imidlertid, hvis større sår samme…

Materials

Pasteur pipette	VWR	14672-400	Lime Glass
Size 5 3/4’’			Cotton Plugged
			Disposable
Graduated Transfer Pipette	VWR	16001-180	Disposable
			Polyethylene
#5/45 forceps	Fine Science Tools by Dupont medical	11251-35	Angled 45 degrees
Standard Pattern Forceps	Fine Science Tools	11000-20	Straight; serrated tip
			Stainless Steel;
			20cm long
Capillary Tubing (for needles)	FHC	30-30-1	Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber
			100mm each
Cover slip	VWR	48393 252	24x60mm
micro cover glass		or	or
(for glass bridges)		48393 230	24x40mm
No.1.5
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Needle Puller	Sutter Instrument Co	Needle Puller: discontinued Filament: FB300B	The most similar, currently available  needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.
Model P-80	Flaming / Brown micropipette puller
(discontinued)
Stereomicroscope	Zeiss
Zeiss Stemi 1000
Stereomicroscope Lighting by Fostec	Fostec		Use a light box with 2 fiberoptic arms.
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17	Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm
			Length: 17cm
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Jaw opening Diameter: 0 to 1mm
			Length: 12cm
Tungsten Needles	Fine Science Tools	10130-05	0.125mm Rod diameter
Van Aken Plastalina	Blick	#33268-2981
Modeling Clay- white, red or yellow
mMessage mMashine SP6 or T7 Kit	Ambion	AM1340