Humanen endogenen Retroviren (HERV), die 8% des menschlichen Genoms zu besetzen, halten knapp Codierung Kapazitäten aber hunderttausend long terminal repeats (LTR). Eine benutzerdefinierte Affymetrix-Microarray wurde entwickelt, um einzelne HERV Expression Ort identifizieren und wurde auf Prostata-Krebsgewebe als Proof of Concept für zukünftige klinische Studien verwendet.
Das Prostata-spezifische Antigen (PSA) ist das wichtigste diagnostische Biomarker für Prostatakrebs im klinischen Einsatz, aber es fehlt die Spezifität und Empfindlichkeit, insbesondere bei niedrigen Dosierungswerten 1. 'Wie PSA verwenden "bleibt ein aktuelles Thema, weder für die Diagnose als Grauzone, die einer Konzentration im Serum von 2,5 bis 10 ng / ml, die nicht zulässt, dass eine klare Unterscheidung zwischen Krebs und noncancer 2 oder für Patienten Follow gemacht werden -up als Analyse der postoperativen PSA kinetischen Parameter können erhebliche Herausforderungen für ihre praktische Anwendung 3,4 darstellen. Alternativ sind nicht-kodierende RNAs (ncRNAs) als Schlüsselmoleküle in menschlichen Krebsschwellen, mit dem Potenzial, als neuartige Marker der Krankheit dienen, z. B. in PCA3 Prostatakrebs 5,6 und uncharacterized Aspekte der Tumorbiologie zu offenbaren. Darüber hinaus Daten aus dem ENCODE-Projekt im Jahr 2012 veröffentlicht wurden, zeigten, dass verschiedene RNA-Typen decken etwa 62% der Gen-ome. Es scheint auch, daß die Menge des Transkriptionsregulationsmotive mindestens 4,5 x höher als die entsprechende Protein-codierenden Exons. So lange terminale Wiederholungen (LTRs) von menschlichen endogenen Retroviren (HERVs) bilden eine Vielzahl von putativen / Kandidaten-Transkriptionsregulationssequenzen, wie es ihre primäre Funktion in infektiöse Retroviren ist. HERVs, die in der gesamten menschlichen Genom verteilt sind, stammen aus uralten und unabhängige Infektionen in der Keimbahn, gefolgt von Copy-Paste Ausbreitungsvorgänge und führt zu Mehrfachkopien-Familien besetzen 8% des menschlichen Genoms (beachten Sie, dass Exons erstrecken 2% unseres Genoms ). Einige HERV loci noch Proteine exprimieren, die mit verschiedenen Krankheiten, darunter Krebs 10.7 in Verbindung gebracht wurden. Wir haben eine High-Density-Microarray entwickelt, in Affymetrix-Format, mit dem Ziel, optimal charakterisieren einzelnen HERV-Loci Ausdruck, um besser zu verstehen, ob sie aktiv sein können, wenn sie ncRNA Transkription oder m fahrenodulate Codierung Genexpression. Dieses Tool wurde in der Prostatakrebs-Feld (Abbildung 1) angewendet.
Menschen endogenen Retroviren (auch HERVs) sind in unserer gesamten Genom verteilt. Sie stammen aus uralten und unabhängige Infektionen in der Keimbahn, gefolgt von Copy-Paste Ausbreitungsvorgänge und führt zu Mehrfach Familien. Heute sind sie nicht mehr infektiös, aber sie besetzen 8% des menschlichen Genoms, als Vergleichspunkt, Exons erstrecken 2% des menschlichen Genoms. Daten aus dem ENCODE-Projekt im Jahr 2012 veröffentlicht wurden, zeigten, dass verschiedene RNA-Typen decken etwa 62% des Genoms, darunter ein Drittel in intergenischen Regionen. Außerdem scheint es, daß die Menge des Transkriptionsregulationsmotive mindestens 4,5 x höher als die entsprechende Protein-codierenden Exons. HERVs long terminal repeats (LTR) repräsentieren ein breites Spektrum von potentiellen Transkriptionsregulationselemente, wie sie ihre übliche Funktion bei infektiösen Retroviren ist. Historisch gesehen, abgesehen von ein paar Loci in der Plazenta oder Hoden exprimiert, wurde allgemein angenommen, dass HERV schweigen aufgrund epigenetic Regulierung. Daher haben wir eine High-Density-Microarray entwickelt, in Affymetrix-Format, mit dem Ziel, optimal charakterisieren einzelnen HERV-Loci Ausdruck, um besser zu verstehen, ob sie aktiv sind, wenn sie Auto fahren oder lncRNA Transkription modulieren Codierung Genexpression. Dieses Tool synchronisiert HERV-V2 Genechip integriert HERV 23.583 Probesets und kann 5.573 verschiedene Elemente der HERV-LTRs solo komponiert sowie Komplett-und Teil Proviren (Abbildung 2) zu unterscheiden.
Diagnose, Beurteilung und Plan:
Diagnose von Prostatakrebs wird über die Dosierung des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) Biomarker in klinischen Labors, einer digitalen rektalen Untersuchung der morphologischen Veränderung der Prostata und schließlich durch den Pathologen beobachtet Prostatabiopsien auszuwerten basiert. Der Mangel an ausreichender Spezifität und Empfindlichkeit unter den herkömmlichen Biomarkern, z. B. PSA für Prostatakrebs, wurde allgemein anerkannt, afTer mehreren Jahrzehnten der klinischen Implikationen ein. Zunächst wurde PSA für die Diagnose und Behandlung von Prostata-Adenokarzinom 11 vorgeschlagen. Es war letzteres für die Krebsvorsorge vorgeschlagen und die Überwachung der Entwicklung der Krankheit 12. Es bleibt jedoch eine Frage, die regelmäßig gefragt wird: "Wie PSA verwenden. (I) Eine Grauzone, die einer Konzentration im Serum von 2,5 bis 10 ng / ml nicht zu einem klaren Unterschied zwischen Krebs und noncancer 2 hergestellt werden, (ii) zwei große Kohortenstudien Einschreibung Hunderttausende von Menschen in Europa und USA versäumt, eine klare Aussage über den Nutzen von Screening im Hinblick auf krankheitsspezifische Mortalität 13,14 kommen, (iii) Analyse der postoperativen PSA kinetischen Parameter wie PSA Abfertigung, PSA-Geschwindigkeit und-Verdopplungszeit, obwohl in der Theorie einfach, können erhebliche Herausforderungen in der praktischen Anwendung 3,4 darstellen. Wir können, dass in den kommenden Jahren zu erwarten, Biomarker-Appchungen wird eine klinische Wahl zwischen beobachtendes Abwarten und mehr oder weniger aggressive Behandlungen je nach Tumor-Phänotyp zu unterstützen. Bezüglich der Diagnose durch den Pathologen gemacht, stammt eine erste limitierende Faktor von 20% falsch-negative Diagnose innerhalb Prostata-Biopsien (viele Krebsarten sind durch Stichproben verpasst). Ein zweites Anliegen befasst sich mit der Notwendigkeit für eine zusätzliche Biopsie nach einem negativen ein, die schädliche Auswirkungen darstellen können.
Radikale Prostatektomie ist derzeit eines der Standard-Behandlungen für Prostatakrebs. Es wird bei gesunden Patienten vorgeschlagen, Alterung 45-65 Jahren, vor allem im Falle von aggressiven Muster (Gleason 7 bis 10), multifokaler Tumor oder Tumor tastbar. Es ist nun in unserer Abteilung mit Roboter-assistierte Chirurgie getan. Aufgrund der zunehmend Beweise, dass molekulare Marker wird größter Bedeutung in den kommenden Jahren haben wir beschlossen, für alle unsere Patienten schlagen die Möglichkeit der Teilnahme an einem Programm für ProstataGewebebanken. Genauer gesagt, haben die expandierenden molekularen Forschungsprogramme auf Prostata-Krebs in einem zunehmenden Bedarf an Zugang zu qualitativ hochwertigen frischen Tumorgewebe von Prostatektomie Proben geführt. Diese Forschung, insbesondere die genomische Ansätze erforderlichen großen Proben hoher DNA / RNA-Qualität. Tumor und benachbarten "nicht tumorale" Gewebe des gleichen Patienten benötigt. Empfehlungen für die Handhabung und Verarbeitung von radikalen Prostatektomie sind entworfen, um pathologischen Merkmale, die Bühne und Marge Status und damit mögliche weitere Behandlung und Prognose festzustellen, zu bewahren. Jede frische Gewebeprobenahmeverfahren sollte daher keine Kompromisse anschließenden pathologischen Einschätzungen, um akzeptabel zu der Diagnose sein. Makroskopische Präparation der Prostata ist schwierig und große Aufmerksamkeit muss den Rand Gewebe und Kapsel Invasion bezahlt werden: jede Präparation für Prostata-Banking sollten immer von einem geschulten uropathologist nach einer Vereinbarung durchgeführt werdend-Protokoll. Die Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät und der Ärztekammer vereinbart, diese Untersuchungen und informierte Zustimmung erhalten für alle Patienten in der Prostata-Gewebe-Banking enthalten.
In den letzten 10 Jahren wurden die meisten Versuche zur Expression HERV Messung wurden RT-PCR-Techniken verwendet werden, entweder über einen spezifischen Locus 20-24 oder basierend auf der relativen Erhaltung der pol-Gene auf allgemeine Trends in HERV Gattungen 25,26 bewerten konzentrieren . Zusätzlich PCR-Amplifikationen mit hoch degenerierten Primern gepaart mit niedrigen Dichte Microarrays bestimmt zu erkennen und zu quantifizieren, die Expression von HERV Familien 27,28. Um die Expression einzelner Locus innerhalb einer Familie zu verfolgen, Ansätze, die auf der PCR-Amplifikation von konservierten Regionen kombiniert mit anschließender Klonierung und Sequenzierung der Basis aktiviert transkriptionell aktiv verschiedene Elemente der HML-2 29,30 oder 31 E4.1 HERV-Familien identifiziert werden. Auch endet durch Klonierung und Sequenzierung Schritte, das Genom Repeat Expressionsüberwachungstechnik mit dem Ziel, unter den Promotoren identifiziert wiederholt aktiv HML-2-spezifischen menschlichen einsamen LTRs identifizieren <sup> 32,33. Wir sukzessive entwickelt, zwei Generationen von High-Density-Microarrays zur Analyse von HERV Transkriptom gewidmet, die Einführung Methoden für eine wiederholte Element-Sonde Design, um Kreuzreaktionen zwischen paralogen Elemente innerhalb einer Familie 34,35 minimieren. Die HERV-V2-Chip, der 2690 und 2883 deutliche Proviren Solo-LTRs von HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 und HERV-K HML-5 Familien richtet, stellte die Expression von HERV 1718 Loci (7A und B) in einer Vielzahl von Geweben 35, in dieser Arbeit durch die Identifizierung von mutmaßlichen Prostatakrebs Biomarker veranschaulicht. Darüber hinaus ist die Verwendung von mehreren Probesets auf einem bestimmten Locus informative um seine Transkriptionsregulation. Zunächst wird ein negatives Signal U3 in Verbindung mit einer U5 positiv klassifiziert die LTR als Promotor, und umgekehrt U3 positive und negative Signale U5 kann eine Polyadenylierung Rolle zu reflektieren. Damit haben wir identified 326 Promoter LTRs in einer breiten Palette von Geweben 35 und auf der Grundlage dieser U3-U5 dichotome Informationen von der Anordnung vorgesehen ist, haben wir vorgeschlagen und experimentell für einige ausgewählte Fälle bestätigt, dass solche autonomen Transkription wurde durch eine Methylierung abhängig epigenetischer Prozess 34 (gesteuert 8). Zweitens, die Erfassung von Signalen von zB LTR, gag und env unabhängige Probesets oder von Sonden auf bestimmte Spleißstelle ausgestellt ist informativ über die proviraler Spleißen Strategie, wie von der ERVWE1/Syncytin1 Expressionsprofil in der Plazenta oder in Tumor Hoden 34 veranschaulicht. Dies zeigt an, dass der Prozess des HERV-spezifischen Sonde Auswahl robust genug ist, um die Identifizierung von Gewebe-assoziierten Spleiß Strategie so effizient wie für herkömmliche Gene 36 (Fig. 8) unterstützt.
Diese Methode ist der erste Versuch, individuell HERV Expression Ort identifizierenmit einem benutzerdefinierten hoher Dichte basierend auf Microarray-Technologie von Affymetrix. Die eindeutig identifiziert Vorteile der Microarray-Format zu HERV Transkriptom, bestehend aus (i) entschlüsseln die koordinierte Erforschung verschiedener HERV Familien und (ii) das gleichzeitige und unabhängige Analyse der verschiedenen Regionen für jeden Locus, z. B.. U3 und U5 Domains für Solo-und proviralen LTR, gag oder env-Regionen und mögliche gespleißt Kreuzungen mit proviralen Strukturen verbunden, ohne von vornherein auf die Funktionalität des HERV-Element. Perspektiven verlassen sich auf eine Verbesserung der Anmerkungen in den Microarray-assoziierten Bioinformatik-Tools. Damit sollte ein Chipsignale in biologischen Hypothesen belegt beispielsweise, ob aktiv HERVs fahren lncRNA Transkription oder modulieren, mehr oder weniger proximalen Codierung Genexpression zu konvertieren. In der Tat wird diese Vermutung durch die jüngsten Studien, die Prostata-Krebs-assoziierte ncRNA Transkripten, die Komponenten von v identifiziert unterstütztIRAL ORFs aus der HERV-K endogenen Retrovirus-Familie oder Teile eines viralen LTR-Promotor-Region 37, sowie zwei Genfusionsereignisse nämlich HERV-K22q11-ETV1 und HERV-K17-ETV 38,39. Zusammengenommen können diese ganze Transkriptom-Ansatz verbunden mit LTR-Funktion und Spleiß-Strategie Identifikationen helfen, um den Marker im Vergleich zu den Trigger-Komponenten von HERV-Expression in der chronischen Infektionskrankheiten und 40,41 42,43 entziffern.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard und Bertrand Bonnaud für ihren Beitrag zu der anfänglichen Entwicklung und Optimierung der HERV-V2-Protokoll. Wir möchten auch Hader Haidous für seine Leitlinien für ethische Überlegungen danken.
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
EQUIPMENT | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
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HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |