مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات
Summary
المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة.
Abstract
المركزية إلى ميدان المرضية البكتيرية هي القدرة على تحديد إذا وكيف الميكروبات البقاء على قيد الحياة بعد التعرض للخلايا حقيقية النواة. وتشمل البروتوكولات الحالية لمعالجة هذه الأسئلة فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. العد مستعمرة وحماية الجنتاميسين فحوصات تقييم الجدوى فقط من السكان البكتيرية كامل وغير قادر على تحديد الجدوى البكتيرية الفردية. ويمكن استخدام المجهر الإلكتروني لتحديد الجدوى من البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن التوطين في الخلايا المضيفة. ومع ذلك، في كثير من الأحيان بكتيريا عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات، مما يجعل من الصعب تقييم الجدوى. توضح هذه المقالة بروتوكولات لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تكشف عن قابلية البكتيريا الفردية داخل ويترافق مع الخلايا المضيفة. وقد وضعت هذه المقايسات أصلا لتقييم بقاء النيسرية البنية في العدلات الإنسان الأساسية، ولكن ينبغي أن يكونpplicable إلى أي تفاعل الخلية البكتيريا في استضافة. الجمع بين هذه البروتوكولات الأصباغ الفلورية غشاء نفاذية (SYTO9 و4 '،6-diamidino-2-phenylindole [دابي])، والتي وصمة عار جميع البكتيريا، مع الأصباغ غشاء كتيمة الفلورسنت (يوديد propidium وSYTOX الأخضر)، والتي يمكن الوصول إليها فقط ل البكتيريا غير قابل للحياة. قبل permeabilization الخلية حقيقية النواة، يتم إضافة الجسم المضاد أو كاشف الفلورسنت لتحديد البكتيريا خارج الخلية. وبالتالي هذه المقايسات تميز جدوى من البكتيريا تمسكا وداخل الخلايا حقيقية النواة. ويرد البروتوكول أيضا لاستخدام الأصباغ جدوى في تركيبة مع الأجسام المضادة لعلامات الفلورسنت خلية حقيقية النواة، من أجل تحديد توطين التحت خلوية من البكتيريا الفردية. الأصباغ البكتيرية الجدوى مناقشتها في هذه المقالة هي تكملة الحساسة و / أو بديل لتقنيات علم الأحياء المجهرية التقليدية لتقييم جدوى البكتيريا الفردية وتقديم معلومات بشأن مكان البقاء على قيد الحياة البكتيريا في الخلية المضيفةق.
Introduction
هناك ديناميكية التفاعل والتطور المشترك بين البكتيريا والمضيفين التي يقيمون فيها. وقد تطورت البكتيريا العضيات الالتزام، ونظم إفراز و / أو القدرة على إنتاج السموم التي تمكن العدوى الإنتاجية الخاصة بهم من أكلة المضيف والخلايا غير البلعمية. يجب على البكتيريا أيضا يتعامل مع الاعتراف والأنشطة المضادة للميكروبات الجهاز المناعي المضيف. ويتألف الجهاز المناعي مجموعة من المكونات الفطرية والتكيفية بما في ذلك الحواجز الفيزيائية والكيميائية، الخلايا المناعية، ونظام مكمل، وغيرها من عناصر الحصانة الخلطية. بينما العديد من أنواع البكتيريا هي عرضة للقتل والتطهير من قبل المضيف المناعي استجابة متعددة الطبقات، تطورت بعض أنواع البكتيريا المسببة للأمراض الانتهازية وآليات لتصيب مجموعة متنوعة من الخلايا المضيفة وتخريب التخليص من قبل المضيف المناعي استجابة 1. النيسرية البنية هو مثال واحد من العوامل المسببة للأمراض البكتيرية التي يتم تكييفها للغاية أن تستمر في المضيف الإنسان. N. البنية يستعمر بسهولة السطوح اللمعية من الخلايا الظهارية المخاطية من الجهاز البولي التناسلي والبلعوم والملتحمة، والمستقيم. الاستعمار يتسبب في التوظيف وفيرة من العدلات في مواقع المخاطية. العدلات هي البالعات المهنية التي تمتلك مجموعة متنوعة من العمليات المضادة للجراثيم لقتل الكائنات الحية الدقيقة، ومع ذلك، N. البنية غير قادرة على البقاء في وجود العدلات 2-5. فهم كيفية مسببات الأمراض البكتيرية مثل N. البنية تخريب، وقمع، وخطف الاستجابة المناعية البقاء على قيد الحياة في نهاية المطاف في بيئات معادية المضيف عادة هو أمر حاسم في تطوير علاجات جديدة لمكافحة الأمراض المعدية.
البروتوكولات التجريبية غالبا ما تستخدم للتحقيق بقاء البكتيريا في الخلايا المضيفة تشمل فحوصات العد مستعمرة، المقايسات حماية الجنتاميسين، والمجهر الإلكتروني. في فحوصات العد مستعمرة، ويبلغ عدد سكانها هي lysed الخلايا المصابة (على سبيل المثال، مع المنظفات لذوي الخوذات البيضاءمعنوى البكتيريا مقاومة) لتحرير البكتيريا. وتضعف لست] ومطلي على وسائل الاعلام القائمة على أجار، ويتم تعداد الوحدات المكونة للمستعمرة في لست] لكل نقطة زمنية و / أو حالة تجريبية. هذا النهج تقارير الجدوى من السكان البكتيرية بأكمله ولكن غير قادر على التفريق بين الخلايا والبقاء على قيد الحياة خارج الخلية. وهناك تباين في مقايسة العد مستعمرة، مقايسة حماية الجنتاميسين، يقيس على وجه التحديد بقاء البكتيريا داخل الخلايا، استنادا إلى عدم قدرة جنتاميسين مضاد حيوي لعبور حقيقية النواة غشاء البلازما 6. ومع ذلك، هذا الاختبار يعتمد على البكتيريا كونها عرضة للقتل من قبل جنتاميسين (أو مضاد حيوي آخر هو بالمثل حقيقية النواة غشاء impermeant) وعدم قدرة المضاد الحيوي على الوصول إلى البكتيريا الداخلية. وبالتالي، مقايسة حماية الجنتاميسين قد لا تكون فعالة لفحص كل أنواع البكتيريا أو عند النظر في البقاء على قيد الحياة البكتيرية للغايةخلايا pinocytic مثل العدلات. لم يكن أي من هذه الطرق يكشف توطين التحت خلوية أو أي سلوك آخر من البكتيريا الفردية (على سبيل المثال إذا كانت البكتيريا تشكيل المجاميع أو microcolonies أن تتصرف بشكل مختلف من الخلايا البكتيرية الفردية). آخر النهج كثيرا ما تستخدم لدراسة الجدوى من البكتيريا الخارجية والداخلية الفردية رقيقة المقطع انتقال الإلكترون المجهري (TEM). هذا النهج هو مفيد من حيث أنه يمكن أن توفر معلومات بشأن مكان وجود البكتيريا في الخلايا المضيفة (مثل يبلوع، السيتوبلازم، جسيم بلعمي ذاتي)، والتي يمكن أن تحقق مزيدا من immunoelectron المجهري مع الأجسام المضادة إلى جانب الذهب ضد علامات التحت خلوية. ومع ذلك، المجهر الإلكتروني ليست حساسة ولا سيما في تقييم الجدوى البكتيرية. عندما يتم ملطخة أقسام جزءا لا يتجزأ مع خلات اليورانيل، سترات الرصاص، أو غيرها من الكواشف الإلكترون الكثيفة والتقط بواسطة المجهر الإلكتروني، وتعتبر البكتيريا الإلكترون كثيفة قابلة للحياة وكهربائيTRON-وسنت غير قابل للحياة 7،8. ولكن هذا الافتراض يغالي بقاء البكتيرية، ومنذ تلك البكتيريا الميتة فقط مع الأغشية تعطلت بشدة وتخلو من السيتوبلازم تظهر الإلكترون لوسنت. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون بعض الأنواع البكتيرية عرض مجموعة من كثافة الإلكترونات اعتمادا على مرحلة نموها، مما يجعل من الصعب تحديد الجدوى.
كبديل أو بالإضافة إلى هذه الأساليب تستخدم على نطاق واسع، وهنا نقدم بروتوكولات والأساس المنطقي لاستخدام الأصباغ الفلورية التي تشير إلى بقاء البكتيرية لتقييم بقاء البكتيريا التي تعلق على والمنضوية بواسطة الخلايا المضيفة. لتحديد البكتيريا خارج الخلية يتم، أولا، تتعرض الخلايا المصابة إلى كاشف الفلورسنت، مثل كتين أو الأجسام المضادة البكتيريا محددة. ثم يتم permeabilized الخلايا المصابة والمعرضة للالأصباغ الحمض النووي المحددة التي يمكن الوصول إليها بشكل مختلف للبكتيريا مع الأغشية سليمة مقابل المتدهورة، كبديل للبقاء البكتيرية. في ع الأولrotocol، يحدد غشاء منفذ صبغ SYTO9 مجموع السكان البكتيرية، في حين يوديد propidium هو فقط للوصول الى تلك البكتيريا التي أثرت سلبا الأغشية، وبالتالي فهي تعتبر غير قابل للحياة. وقد استخدمت يوديد propidium وSYTO9 لتقييم الجدوى البكتيرية في الأغشية الحيوية، تميز الممرضة من بكتيريا غير إمراضية، وتعداد البكتيريا التي تنتقل عن طريق المياه قابلة للحياة 9-12. في البروتوكول الثاني، 4 '، 6'-diamidino-2-phenylindole (دابي) يحدد مجموع البكتيريا، في حين SYTOX الأخضر هو فقط للوصول الى السكان غير قابل للحياة. هذه الأزواج بقاء الصبغة يمكن الجمع بين المناعي لتحديد موقع كل البكتيريا في ما يتعلق بروتين من الفائدة، على سبيل المثال لتعريف توطين التحت خلوية البكتيرية. استخدام هذه المقايسات يقدم رؤية المفتاح في التفاعلات التي تؤدي إلى قتل البكتيريا أو البقاء على قيد الحياة خلال العدوى من الخلايا المضيفة. تم استخدام البروتوكولات المذكورة في هذه المقالة لتقييم جدوىN. البنية التي يتم تركيبها داخل والعدلات الإنسان الأساسية، بما في ذلك مجموعات مختلفة من phagosomes العدلة 5،13،14. ومع ذلك، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها لتقييم الجدوى من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام في البالعات المهنية، البالعات غير المهنية، والبروتوزوا 15-24.
Protocol
Representative Results
Discussion
المقدمة هنا نوعان من البروتوكولات التي تستخدم الحمض النووي ملزمة والأصباغ جدوى بالتزامن مع كتين الفلورسنت لتحديد البكتيريا الحية والميتة وتعلق داخل الخلايا البشرية. لأن كلا من بروتوكولات تميز بفعالية الحية من البكتيريا الميتة، واختيار أي بروتوكول لاستخدام يعتمد ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بنك آسيا سميرنوف ولورا Gonyar لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة وأيد منح R00 R01 TW008042 وAI097312 لAKCMBJ في جزء من المعاهد الوطنية للصحة AI007046 T32.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
