Fluorescensmikroskopi Metoder til bestemmelse af levedygtighed Bakterier i foreningen med pattedvrceller
Summary
Centralt i området af bakteriel patogenese er evnen til at definere, om og hvordan mikrober overlever efter udsættelse for eukaryote celler. Denne artikel beskriver protokoller for brugen af fluorescerende farvestoffer, der afslører levedygtigheden af de enkelte bakterier inde og forbundet med værtsceller.
Abstract
Centralt i området af bakteriel patogenese er evnen til at definere, om og hvordan mikrober overlever efter udsættelse for eukaryote celler. Aktuelle protokoller til at løse disse spørgsmål omfatter kimtal assays, gentamicin beskyttelse assays og elektronmikroskopi. Kimtal og gentamicin beskyttelse assays kun vurdere levedygtigheden af hele den bakterielle population og ikke er i stand til at afgøre individuelle bakteriel levedygtighed. Elektronmikroskopi kan anvendes til at bestemme levedygtigheden af de enkelte bakterier og give oplysninger om deres lokalisering i værtsceller. Bakterier ofte en række elektron tætheder, hvilket gør bedømmelse af levedygtighed vanskelig. Denne artikel beskriver protokoller for brugen af fluorescerende farvestoffer, der afslører levedygtigheden af de enkelte bakterier inde og forbundet med værtsceller. Disse assays blev oprindeligt udviklet til at vurdere overlevelsen af Neisseria gonorrhoeae i primære humane neutrofiler, men bør være etpplicable enhver bakterie-vært-interaktion celle. Disse protokoller kombinere membran-gennemtrængelige fluorescerende farvestoffer (SYTO9 og 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), der farver alle bakterier med membran-impermeabel fluorescerende farvestoffer (propidiumiodid og SYTOX Green), som kun er tilgængelig for levedygtige bakterier. Forud for eukaryot celle permeabilisering tilsættes et antistof eller fluorescerende reagens til at identificere ekstracellulære bakterier. Således disse assays diskriminere levedygtigheden af bakterier klæbende til og inde i eukaryote celler. En protokol er også tilvejebragt til anvendelse levedygtighed farvestoffer i kombination med fluorescerende antistoffer til eukaryote cellemarkører, for at bestemme den subcellulære lokalisering af de enkelte bakterier. De bakterielle levedygtighed farvestoffer omtales i denne artikel er en følsom supplement og / eller alternativ til traditionelle mikrobiologi teknikker til at vurdere levedygtigheden af de enkelte bakterier og give oplysninger om, hvor bakterier overleve i værtscellesek.
Introduction
Der er en dynamisk interaktion og samarbejde evolution mellem bakterier og værter, hvor de bor. Bakterier har udviklet compliance organeller, sekretion systemer, og / eller evnen til at producere toksiner, der giver deres produktiv infektion af værtens fagocytiske og ikke-fagocytceller. Bakterierne skal også kæmpe med anerkendelse og antimikrobielle aktiviteter af værtens immunsystem. Værtens immunsystem består af medfødte og adaptive komponenter, herunder fysiske og kemiske barrierer, immunceller, komplementsystemet, og andre dele af humoral immunitet. Mens mange bakterier er modtagelige for drab og efter en flerlaget værtens immunrespons, har nogle patogene og opportunistiske bakterier udviklet mekanismer til at inficere en række værtsceller og undergrave efter værtens immunrespons 1. Neisseria gonorrhoeae er et eksempel på et bakterielt patogen der er meget tilpasset til at fortsætte i sin menneskelige vært. N. gonorrhoeae let koloniserer de luminale overflader af mucosale epithelceller urogenitalkanalen, svælget, bindehinde og endetarmen. Colonization udløser rigelige rekruttering af neutrofiler på slimhinder. Neutrofiler er professionelle fagocytter, der besidder en række antimikrobielle fremgangsmåder til at dræbe mikroorganismer, men N. gonorrhoeae er i stand til at overleve i nærvær af neutrofiler 2-5. Forstå, hvordan bakterielle patogener som N. gonorrhoeae undergrave, undertrykke og kapre immunrespons til sidst at overleve i normalt fjendtlige værtsmiljøer er afgørende for udviklingen af nye behandlingsformer til bekæmpelse af smitsomme sygdomme.
Forsøgsprotokoller ofte bruges til at undersøge bakteriel overlevelse i værtsceller indbefatter kimtal assays, gentamicin beskyttelse assays og elektronmikroskopi. I kimtal analyser, er en population af inficerede celler lyseres (for eksempel med et rengøringsmiddel til which bakterierne er resistente) at befri bakterier. Lysaterne fortyndet og udpladet på agar-baserede medier, og kolonidannende enheder i lysaterne optælles for hvert tidspunkt og / eller eksperimentel betingelse. Denne fremgangsmåde rapporterer levedygtigheden af hele bakteriepopulation, men ikke er i stand til at skelne mellem intracellulære og ekstracellulære overlevelse. En variation på kimtal assay gentamicin beskyttelse assayet specifikt måler intracellulær bakteriel overlevelse, baseret på den manglende evne af de antibiotiske gentamicin at krydse eukaryot plasmamembranen 6. Men dette assay er afhængig af bakterierne bliver modtagelige for drab med gentamicin (eller et andet antibiotikum, som er tilsvarende eukaryot membran-impermeabel) og den manglende evne af antibiotikummet at have adgang til interne bakterier. Derfor kan en gentamicin beskyttelse assay ikke være effektiv for undersøgelse af alle bakteriearter eller i undersøgelsen af bakteriel overlevelse i stærktpinocytic celler såsom neutrofiler. Ingen af disse tilgange afslører den subcellulære lokalisering eller anden adfærd enkelte bakterier (fx hvis bakterierne danner aggregater eller mikrokolonier der opfører sig forskelligt fra de enkelte bakterieceller). Et andet ofte anvendt metode til at undersøge levedygtigheden af de enkelte eksterne og interne bakterier tynd sektion transmissionselektronmikroskopi (TEM). Denne fremgangsmåde er fordelagtig, idet den kan give oplysninger om placeringen af bakterierne i værtsceller (f.eks phagosome, cytoplasma, autophagosome), som kan undersøges nærmere af immunoelektronmikroskopi med guld-koblede antistoffer mod subcellulære markører. Men elektronmikroskopi er ikke specielt følsom på at vurdere bakteriel levedygtighed. Når indlejrede sektioner farves med uranylacetat, bly-citrat eller andre elektron-tætte reagenser, og afbildet ved elektronmikroskopi, er elektron-tætte bakterier betragtes som levedygtige og elektrotron-Lucent nonviable 7,8. Men denne antagelse overvurderer bakteriel levedygtighed, da kun de døde bakterier med alvorligt forstyrret membraner og blottet for cytoplasma vises elektron-Lucent. Desuden kan nogle bakteriearter vise en række elektron tætheder afhængig af deres vækststadium, hvilket gør det vanskeligt at bestemme levedygtighed.
Som et alternativ eller i tillæg til disse udbredte metoder, vi her give protokoller og rationale for anvendelse af fluorescerende farvestoffer, som indikerer bakteriel levedygtighed til at vurdere overlevelsen af bakterierne, der er knyttet til og er internaliseret gennem værtsceller. For at identificere ekstracellulære bakterier er inficerede celler først udsat for et fluorescerende reagens, såsom et lectin eller bakterie-specifikke antistof. De inficerede celler bliver derefter permeabiliseret og udsættes for DNA-specifikke farvestoffer, der er differentielt tilgængelige for bakterier med intakt vs uregelmæssige membraner, som et surrogat for bakteriel levedygtighed. I den første protokol membranen gennemtrængelig farvestof SYTO9 identificerer den totale bakterielle population, mens propidiumiodid kun er tilgængelig for de bakterier, der har kompromitteret membraner og anses derfor nonviable. Propidiumiodid og SYTO9 er blevet anvendt til at evaluere bakteriel levedygtighed biofilm diskriminere patogene fra ikke-patogene bakterier, og optælle levedygtige vandbårne bakterier 9-12. I den anden protokol, 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindol (DAPI) identificerer samlede bakterier, mens SYTOX Green er kun tilgængelig for nonviable befolkning. Disse levedygtighed farvning par kan kombineres med immunfluorescens for at bestemme hver bakterie placering i forhold til et protein af interesse, for eksempel til at definere bakteriel subcellulære lokalisering. Anvendelsen af disse assays giver vigtige indblik i de interaktioner, der resulterer i bakteriel drab eller overlevelse under infektion af værtsceller. De protokoller, der er skitseret i denne artikel er anvendt til at vurdere levedygtigheden afN. gonorrhoeae, der er fastgjort til og inde primære humane neutrofiler, herunder i forskellige populationer af neutrofile phagosomes 5,13,14. Dog kan anvendes disse protokoller til at vurdere levedygtigheden af gram-positive og gram-negative bakterier i professionelle fagocytter, ikke-erhvervsmæssige fagocytter, og protozoer 15-24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenteres to protokoller, der anvender DNA-binding og levedygtighed farvestoffer i forbindelse med en fluorescerende lectin at identificere levende og døde bakterier er knyttet til og inde humane celler. Da begge protokoller effektivt diskriminere live fra døde bakterier, valget af hvilken protokol til at bruge, afhænger af målet for forsøget. Den første protokol bruger propidiumiodid at opdage levedygtige bakterier og SYTO9 at opdage intakte bakterier. Vist i figur 4A er et repræsentativt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Asya Smirnov og Laura Gonyar for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud NIH R00 TW008042 og R01 AI097312 til AKCMBJ blev delvist understøttet af NIH T32 AI007046.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
