Fluorescentiemicroscopiemethodes voor het bepalen van de levensvatbaarheid van bacteriën in Associatie met zoogdiercellen
Summary
Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen.
Abstract
Centraal in het gebied van bacteriële pathogenese is de mogelijkheid om te bepalen of en hoe microben overleven na blootstelling aan eukaryotische cellen. Huidige protocollen om deze vragen te beantwoorden zijn onder kolonietelling assays, gentamicine protection assays en elektronenmicroscopie. Kiemgetal en bescherming gentamicine assays alleen de levensvatbaarheid van de totale bacteriële populatie te beoordelen en in staat zijn om individuele bacteriële levensvatbaarheid te bepalen. Elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om de levensvatbaarheid van individuele bacteriën bepalen en informatie over hun lokalisatie in gastheercellen. Echter, bacteriën vertonen vaak een aantal elektron dichtheden, waardoor de beoordeling van de levensvatbaarheid moeilijk. Dit artikel beschrijft protocollen voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen die de levensvatbaarheid van individuele bacteriën in en gekoppeld aan gastheercellen onthullen. Deze testen werden oorspronkelijk ontwikkeld om de overleving van Neisseria gonorrhoeae beoordelen in primaire humane neutrofielen, maar moet eenpplicable aan een bacterie-gastheercel interactie. Deze protocollen gecombineerd membraan-permeabele fluorescente kleurstoffen (SYTO9 en 4 ',6-diamidino-2-fenylindool [DAPI]), die alle bacteriën kleuren met membraan-ondoorlaatbare fluorescerende kleurstoffen (propidiumjodide en SYTOX Green), die alleen toegankelijk zijn levensvatbaar bacteriën. Vóór eukaryotische cel permeabilisatie, wordt een antilichaam of fluorescerend reagens extracellulaire bacteriën te identificeren. Dus deze assays discrimineren de levensvatbaarheid van bacteriën aanhanger en in eukaryotische cellen. Een protocol is ook voorzien voor gebruik van de levensvatbaarheid kleurstoffen in combinatie met fluorescente antilichamen tegen eukaryote cel markers om de subcellulaire lokalisatie van individuele bacteriën te bepalen. De bacteriële levensvatbaarheid kleurstoffen besproken in dit artikel zijn een gevoelig aanvulling en / of alternatief voor de traditionele microbiologie technieken om de levensvatbaarheid van de individuele bacteriën evalueren en informatie verstrekken over waar bacteriën overleven in gastheercels.
Introduction
Er is een dynamische interactie en co-evolutie tussen bacteriën en de gastheren waar zij wonen. Bacteriën hechting organellen, secretie systemen, en / of de mogelijkheid om toxines die hun productieve infectie van gastheer fagocytische en niet-fagocytische cellen inschakelen produceren geëvolueerd. De bacteriën moet maken met herkenning en antimicrobiële activiteiten van het gastheerimmuunsysteem. De gastheer immuunsysteem bestaat uit aangeboren en adaptieve componenten, waaronder fysische en chemische barrières, immuuncellen, het complementsysteem, en andere onderdelen van humorale immuniteit. Hoewel veel bacteriën gevoelig voor doden en goedkeuring door het meerlagige immuunrespons hebben sommige pathogene en opportunistische bacteriën mechanismen van verschillende gastheercellen infecteren en ontwrichting goedkeuring door de immuunrespons 1 ontwikkeld. Neisseria gonorrhoeae is een voorbeeld van een bacterieel pathogeen dat is zeer geschikt om te volharden in zijn menselijke gastheer. N. gonorrhoeae koloniseert gemakkelijk de luminale oppervlakken van mucosale epitheliale cellen van het urogenitale kanaal, keelholte, conjunctiva en rectum. Kolonisatie leidt tot de overvloedige rekrutering van neutrofielen bij mucosale sites. Neutrofielen zijn professionele fagocyten die diverse antimicrobiële processen micro-organismen doden bezitten, maar N. gonorrhoeae kan overleven in de aanwezigheid van neutrofielen 2-5. Begrijpen hoe bacteriële pathogenen zoals N. gonorrhoeae ondermijnen, onderdrukken en kapen de immuunrespons uiteindelijk overleven in normaal vijandige hostomgevingen is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor de bestrijding van infectieziekten.
Experimentele protocollen vaak gebruikt om bacteriële overleving onderzoeken gastheercellen omvatten kolonietelling assays, gentamicine protection assays en elektronenmicroscopie. In kiemgetal assays wordt een populatie van geïnfecteerde cellen gelyseerd (bijvoorbeeld met een wasmiddel which de bacteriën resistent) om de bacteriën te bevrijden. De lysaten verdund en uitgeplaat op agar media en kolonievormende eenheden in de lysaten worden geteld voor elk tijdstip en / of experimentele conditie. Deze benadering meldt de levensvatbaarheid van de totale bacteriële populatie, maar is niet in staat onderscheid te maken tussen de intracellulaire en extracellulaire overleving. Een variatie op het kiemgetal assay bescherming gentamicine assay specifiek meet intracellulaire bacteriële overleving, gebaseerd op het onvermogen van de antibiotica gentamicine de eukaryote plasmamembraan 6 steken. Echter, deze test is afhankelijk van de bacteriën gevoelig voor doding door gentamicine (of een ander antibioticum dat eveneens eukaryote membraan-impermeant) en het onvermogen van het antibioticum toegang tot interne bacteriën. Daarom kan een bescherming gentamicine assay niet effectief zijn voor de behandeling van bacteriële soort of bij de behandeling van bacteriële overleving in sterkpinocytose cellen zoals neutrofielen. Geen van deze benaderingen onthult de subcellulaire lokalisatie of ander gedrag van individuele bacteriën (bijvoorbeeld als de bacteriën vormen aggregaten of microkolonies die anders individuele bacteriële cellen zich gedragen). Een andere vaak gebruikte benadering om de levensvatbaarheid van individuele externe en interne bacteriën worden onderzocht dunne plaat transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Deze benadering heeft het voordeel dat het kan informatie over de locatie van de bacteriën in gastheercellen (bijvoorbeeld fagosoom, cytoplasma, autophagosome), die verder kunnen worden onderzocht door immuno-elektronenmicroscopie met goud gekoppelde antilichamen tegen subcellulaire markers. Echter, elektronenmicroscopie is niet bijzonder gevoelig op het beoordelen van bacteriële levensvatbaarheid. Wanneer ingebedde secties worden gekleurd met uranylacetaat, loodcitraat of andere elektron-dichte reagentia en afgebeeld door elektronenmicroscopie worden elektron-dichte levensvatbare bacteriën en elektronische beschouwdtron-Lucent nonviable 7,8. Echter, deze veronderstelling overschat bacteriële levensvatbaarheid, omdat alleen die dode bacteriën met ernstig verstoord membranen en verstoken van cytoplasma verschijnen elektron-Lucent. Bovendien kunnen sommige bacteriesoorten verschillende elektronendichtheden beeldscherm afhankelijk van het stadium van de groei, waardoor het moeilijk levensvatbaar bepalen.
Als alternatief of in aanvulling op deze gebruikte methoden, hier bieden wij protocollen en redenen voor het gebruik van fluorescente kleurstoffen die bacteriële levensvatbaarheid aan om de overleving van bacteriën bevestigd aan en geïnternaliseerd door gastheercellen te beoordelen. Om extracellulaire bacteriën te identificeren, worden geïnfecteerde cellen eerst blootgesteld aan een fluorescerend reagens, zoals een lectine of bacterie-specifiek antilichaam. De geïnfecteerde cellen worden vervolgens permeabel en blootgesteld aan DNA-specifieke kleurstoffen die differentieel toegankelijk bacteriën met intacte versus gedegradeerde membranen als een surrogaat voor bacteriële levensvatbaarheid. In de eerste pROTOCOL, het membraan permeabel kleurstof SYTO9 identificeert de totale bacteriële populatie, terwijl propidiumjodide is alleen toegankelijk voor de bacteriën die membranen hebben gecompromitteerd en worden dus beschouwd als niet-levensvatbaar. Propidiumjodide en SYTO9 zijn gebruikt om bacteriële levensvatbaarheid evalueren biofilms, onderscheiden van pathogene pathogene bacteriën en opsommen levensvatbare watergedragen bacteriën 9-12. In het tweede protocol, 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindool (DAPI) identificeert totale bacteriën, terwijl SYTOX Groen is alleen toegankelijk voor de niet-levensvatbaar bevolking. De levensvatbaarheid kleurstof paren te combineren met immunofluorescentie op locatie elke bacterie bepalen met betrekking tot een eiwit van belang, bijvoorbeeld bacteriële subcellulaire lokalisatie definiëren. Het gebruik van deze assays biedt belangrijke inzicht in de interacties die resulteren in bacteriële doden of overleving tijdens infectie van gastheercellen. De in dit artikel protocollen werden gebruikt om de levensvatbaarheid van beoordelenN. gonorrhoeae die van en in primaire humane neutrofielen, ook in verschillende populaties van neutrofielen phagosomes 5,13,14 bevestigd. Echter, deze protocollen worden toegepast om de levensvatbaarheid van gram-positieve en gram-negatieve bacteriën beoordelen professionele fagocyten, niet-professionele fagocyten en protozoa 15-24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier voorgesteld zijn twee protocollen die gebruik maken DNA binding en levensvatbaarheid kleurstoffen in combinatie met een fluorescerend lectine om levende en dode bacteriën bevestigd aan en in menselijke cellen te identificeren. Aangezien beide protocollen effectief discrimineren live vanuit dode bacteriën, de keuze van welk protocol te gebruiken hangt af van het doel van het experiment. Het eerste protocol gebruikt propidiumjodide om levensvatbaar bacteriën en SYTO9 om intacte bacteriën detecteren detecteren. We…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Asya Smirnov en Laura Gonyar voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies NIH R00 TW008042 en R01 AI097312 om AKCMBJ werd mede ondersteund door NIH T32 AI007046.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
- Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
- Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
- Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
- Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
- Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
- Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
- Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
- Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
- Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
- Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
- Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
- Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
- Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
- Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
- Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
- Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
- Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
- Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
- Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
- Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).
