Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen
Summary
Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren.
Abstract
Zentral auf das Gebiet der bakteriellen Pathogenese ist die Möglichkeit, festzulegen, ob und wie Mikroben nach Einwirkung von eukaryotischen Zellen überleben. Aktuelle Protokolle, um diese Fragen zu beantworten sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl und Gentamicin-Schutztests beurteilen nur die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation und sind nicht in der Lage, einzelne Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen. Elektronenmikroskopie verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu bestimmen und einzelne Informationen hinsichtlich ihrer Lokalisation in Wirtszellen. Allerdings Bakterien zeigen oft eine Reihe von Elektronendichten, was eine Bewertung der Rentabilität schwierig. Dieser Artikel beschreibt Protokolle für den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen, die die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien im Inneren und mit Wirtszellen assoziiert offenbaren. Diese Tests wurden ursprünglich entwickelt, um das Überleben von Neisseria gonorrhoeae in primären humanen neutrophilen Granulozyten zu bewerten, sondern sollte einpplicable einem Bakterium-Wirt-Interaktion. Diese Protokolle kombinieren membranpermeablen Fluoreszenzfarbstoffen (SYTO9 und 4 ',6-Diamino-2-phenylindol [DAPI]), die alle Bakterien färben, mit Membran-undurchlässig Fluoreszenzfarbstoffen (Propidiumiodid und SYTOX Grüne), die nur zugänglich sind nicht lebensfähige Bakterien. Vor der eukaryotischen Zelle Permeabilisierung wird ein Antikörper oder fluoreszierenden Reagens zugegeben, um extrazelluläre Bakterien zu identifizieren. So sind diese Tests unterscheiden die Lebensfähigkeit der Bakterien an und innen eukaryotischen Zellen haften. Ein Protokoll wird auch für die Verwendung der Lebensfähigkeit Farbstoffe in Kombination mit fluoreszierenden Antikörpern gegen eukaryotische Zellmarker, um die subzelluläre Lokalisierung von einzelnen Bakterien zu bestimmen. Die in diesem Artikel behandelt bakterielle Lebensfähigkeit Farbstoffe sind eine sensible Ergänzung und / oder Alternative zu traditionellen Mikrobiologie Techniken, um die Lebensfähigkeit der einzelnen Bakterien zu bewerten und Informationen, wo Bakterien in Wirtszelle überlebens.
Introduction
Es ist eine dynamische Interaktion und Ko-Evolution zwischen Bakterien und den Gastgebern in dem sie wohnen. Bakterien haben die Einhaltung Organellen, die Sekretion Systeme und / oder die Fähigkeit, Giftstoffe, die ihre produktiven Infektion von Wirts phagocytic und nicht-Fresszellen aktivieren produzieren entwickelt. Die Bakterien müssen auch Erkennung und antimikrobiellen Aktivitäten von dem Immunsystem des Wirts zu kämpfen. Das Immunsystem des Wirts wird der angeborenen und erworbenen Komponenten einschließlich der physikalischen und chemischen Barrieren, Immunzellen, die das Komplementsystem und andere Komponenten, der humoralen Immunität besteht. Während viele Bakterien sind empfindlich gegen Tötung und der Freigabe durch Reaktion der mehrschichtigen Immun haben einige pathogene und opportunistische Bakterien Mechanismen, die eine Vielzahl von Wirtszellen zu infizieren und zu untergraben Freigabe durch die Wirtsimmunantwort 1 entwickelt. Neisseria gonorrhoeae ist ein Beispiel für ein bakterielles Pathogen dass ist sehr geeignet ist, in seiner menschlichen Wirt. N bestehen. gonorrhoeae kolonisiert leicht luminalen Oberflächen der Schleimhaut-Epithelzellen des Urogenitaltrakts, des Rachens, der Bindehaut und Rektum. Colonization löst die reichlich Rekrutierung von Neutrophilen bei Schleimhautstellen. Neutrophile Granulozyten sind professionelle Phagozyten, die eine Vielzahl von antimikrobiellen Prozesse zur Abtötung von Mikroorganismen besitzen, aber N. gonorrhoeae ist in der Lage zu überleben, in der Gegenwart von Neutrophilen 2-5. Verstehen, wie bakterielle Erreger wie N. gonorrhoeae zu untergraben, zu unterdrücken, und die Entführung der Immunantwort, um letztlich in der Regel feindlichen Host-Umgebungen zu überleben, ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten.
Versuchsprotokollen häufig verwendet, um bakterielle Überleben in Wirtszellen zu untersuchen sind Koloniezahl-Assays, Gentamicin-Schutztests und Elektronenmikroskopie. Koloniezahl in Assays wird eine Population von infizierten Zellen lysiert (z. B. mit einem Detergens whICH die Bakterien resistent sind), um die Bakterien zu befreien. Die Lysate werden verdünnt und auf Agar-basierten Medien ausplattiert und koloniebildende Einheiten in den Lysaten werden für jeden Zeitpunkt und / oder experimentellen Bedingungen aufgeführt. Dieser Ansatz berichtet die Lebensfähigkeit der gesamten Bakterienpopulation, ist aber nicht in der Lage, die Unterscheidung zwischen intra-und extrazelluläre Überleben. Eine Variation der Koloniezahl-Assay, der Gentamicin-Schutz-Assay misst speziell intrazelluläre Überleben der Bakterien, basierend auf der Unfähigkeit der Antibiotika Gentamicin, die eukaryotische Zellmembran 6 kreuzen. Allerdings ist dieser Test von den Bakterien empfänglich für die Tötung von Gentamicin (oder einem anderen Antibiotikum, das ähnlich eukaryotischen Membran impermeant ist) und die Unfähigkeit des Antibiotikums, um den Zugriff auf interne Bakterien. Daher kann ein Gentamicin-Schutz-Assay nicht effektiv zur Prüfung aller Bakterienarten oder bei der Prüfung überlebenden Bakterien in hochpinocytic Zellen wie Neutrophilen. Keiner dieser Ansätze zeigt die subzelluläre Lokalisation oder andere Verhalten einzelner Bakterien (z. B. wenn die Bakterien bilden Aggregate oder Mikrokolonien, die unterschiedlich von einzelnen Bakterienzellen verhalten). Eine andere häufig verwendete Ansatz, um die Lebensfähigkeit der einzelnen internen und externen Bakterien zu untersuchen ist dünn Schnitt Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Diese Vorgehensweise ist, dass sie Informationen über die Lage der Bakterien in Wirtszellen (zB Phagosom, Zytoplasma, Autophagosom), die durch Immunelektronenmikroskopie mit Gold-gekoppelten Antikörper gegen subzellulärer Marker untersucht werden kann vorteilhaft. Allerdings ist die Elektronenmikroskopie nicht besonders bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit der Bakterien empfindlich. Wenn eingebetteten Abschnitte mit Uranylacetat, Bleicitrat oder andere elektronendichte Reagenzien gefärbt und mittels Elektronenmikroskopie abgebildet sind elektronendichte Bakterien lebensfähig und als elektrotron-Lucent nicht lebensfähigen 7,8. Überschätzt jedoch diese Annahme Lebensfähigkeit der Bakterien, da nur jene toten Bakterien mit schwer gestört Membranen und frei von Zytoplasma elektronenleuchtenden angezeigt. Darüber hinaus können einige Bakterienarten eine Reihe von Elektronendichten in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsphase anzuzeigen, was es schwierig macht, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen.
Als Alternative oder zusätzlich zu diesen verbreiteten Methoden hier stellen wir Protokolle und Gründe für die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die Lebensfähigkeit der Bakterien zeigen, um das Überleben von Bakterien, die an und von Wirtszellen internalisiert zu beurteilen. Extrazelluläre Bakterien zu identifizieren, werden infizierte Zellen zuerst mit einem fluoreszierenden Reagenz, wie ein Lectin oder Bakterien-spezifischen Antikörper ausgesetzt. Die infizierten Zellen werden dann permeabilisiert und DNA-spezifische Farbstoffe, die differentiell zugänglich Bakterien mit intakten Membranen gegen abgebaut, als Ersatz für die Lebensfähigkeit von Bakterien ausgesetzt sind. In der ersten protocol, identifiziert die durchlässige Membran Farbstoff SYTO9 die Gesamtbakterienpopulation, während Propidiumiodid ist nur für jene Bakterien, die Membranen beeinträchtigt haben, und werden daher als nicht lebensfähig. Propidiumiodid und SYTO9 verwendet worden, um die Lebensfähigkeit der Bakterien in Biofilmen zu bewerten, zu unterscheiden von nicht-pathogenen pathogenen Bakterien und aufzählen tragfähige Wasser übertragene Bakterien 9-12. In der zweiten Protokoll, 4 ', 6'-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) identifiziert Gesamt Bakterien, während SYTOX Grün ist nur für den nicht lebensfähigen Bevölkerung. Die Lebensfähigkeit Farbstoffpaare können mit Immunfluoreszenz an Position jedes Bakterium im Vergleich zu einem Protein von Interesse beispielsweise um Bakterien subzelluläre Lokalisierung definieren bestimmen, kombiniert werden. Die Verwendung dieser Assays bietet wichtige Einblicke in die Interaktionen, die in Bakterienabtötung oder Überleben während der Infektion der Wirtszellen führen. Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle wurden verwendet, um die Lebensfähigkeit der BeurteilungN. gonorrhoeae, die innerhalb und primären humanen neutrophilen Granulozyten, auch in verschiedenen Populationen von neutrophilen Phagosomen 5,13,14 angebracht ist. Allerdings können diese Protokolle angewendet werden, um die Lebensfähigkeit von gram-positiven und gram-negative Bakterien in professionellen Phagozyten, nicht-professionellen Phagozyten und Protozoen 15-24 beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Präsentiert hier sind zwei Protokolle, die DNA-Bindung und Lebensfähigkeit Farbstoffe in Verbindung mit einem fluoreszierenden Lektin zu lebenden und toten Bakterien und menschlichen Zellen im Inneren angebracht identifizieren zu verwenden. Da beide Protokolle effektiv live aus toten Bakterien zu unterscheiden, deren Wahl-Protokoll zu verwenden, hängt von dem Ziel des Experiments. Das erste Protokoll verwendet Propidiumiodid zu nicht lebensfähigen Bakterien und SYTO9 intakte Nachweis von Bakterien zu erkennen. In <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Asya Smirnov und Laura Gonyar für das kritische Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse NIH R00 und R01 TW008042 AI097312 zu AKCMBJ wurde zum Teil durch NIH T32 AI007046 getragen wird.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 3/4 butterfly needles for blood collection | Becton Dickinson | 367251 | |
| Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml | Becton Dickinson | 366480 | |
| Sterile water for irrigation | Baxter | 07-09-64-070 | |
| Dextran 500 | Sigma | 31392 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S641 | |
| Dextrose | Ricca Chemical Company | RDCD0200 | |
| Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ | Thermo Scientific | SH3002802 | |
| Ficoll solution | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401 | |
| 12 mm circular glass coverslips | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| 24-well plates | Corning Incorporated | 3524 | |
| Pooled Human Serum | Sigma | S7023 | |
| RPMI | Mediatech | 15-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Human interleukin-8 | R&D Systems | 208-IL/CF | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Propidium Iodide | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| SYTO9 | Life Technologies | L7007 or L7012 | |
| Saponin | Fluka Analytical | 47036 | |
| Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin | Life Technologies | L-32463 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | |
| Mouse anti-CD63 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H5C6 | |
| Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit | Life Technologies | A20187 | |
| Hemacytometer Bright Line | Hausser Scientific | 1492 | |
| Forceps | EMS | 78320 | |
| Sorvall Legend RT + Centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 |
References
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